塞来昔布对人肝癌细胞增殖抑制及放疗增敏作用

王中焕 楚建军 张福正 沈 玲 杨 雪

原发性肝癌是我国高发的恶性肿瘤之一，大多数肝癌患者在发现时已经丧失了手术机会，而介入治疗对肝癌伴门脉癌栓患者效果不佳。放疗是辅助治疗肝癌的有效手段之一，近期， COX-2抑制剂塞来昔布在实体瘤肿瘤辅助治疗中的作用引起研究人员的关注。本实验旨在探讨COX-2抑制剂塞来昔布联合放疗，对人肝癌细胞株huh-7凋亡及细胞周期的影响，以及塞来昔布对huh-7放疗敏感性的影响，为提高肝癌的放疗效果提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人肝癌huh-7细胞株由国家人类基因组南方研究中心韩泽广教授惠赠。塞来昔布为辉瑞公司产品。DMEM高糖培养液、胰蛋白酶(TryPsin)购自南京凯基生物科技发展有限公司；放射治疗设备为美国Varian公司的23EX电子直线加速器；FACS Vantage SE型流式细胞仪为美国BD公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人肝癌细胞株huh-7细胞培养液为高糖DMEM，含10%胎牛血清、青链霉素各100 μl/ml，NaHCO3调节pH至7.2，培养于37℃、5%CO2浓度，饱和湿度培养箱中。Huh-7细胞为贴壁细胞，一般48 h换液1次，待细胞长满瓶底约80%时，用0.25%胰酶消化传代，一般按照1∶3的比例，每48～72 h传代1次。将塞来昔布溶于(dimethylsulfoxide，DMSO)其中配置出浓度为100 μmol/L的母液，放入-20℃冰箱。然后用培养基稀释到所需要的浓度，DMSO终浓度不超过0.1%。

1.2.2 MTT法测定塞来昔布对huh-7 细胞增殖的影响 用胰蛋白酶消化对数生长期的huh-7细胞，制备成单细胞悬液。以每孔 5×103个细胞接种于 96 孔培养板，24 h 后换液,加入不同浓度塞来昔布使其终浓度分别为6.25、12.5、25、50、75、100 μmol/ L。以未进行药物干预的细胞为对照组。每种浓度平行3个复孔，分别于加药后24、48、72 h无菌条件下吸去上清，加入无血清的培养液100 μl/孔，并加入MTT 50 μl/孔，继续培养4 h，吸去每孔的液体，加入DMSO 150 μl/孔，振荡器上振荡溶解 5～10 min，以空白对照调零，应用自动酶标仪，在490 nm波长处测出各实验组的吸光度 A 值。以上实验重复3次。存活率=(药物实验组A平均值/细胞对照组A平均值) ×100%； 抑制率(%)=1-存活率。

1.2.3 细胞的照射与分组 取对数生长期的单细胞悬液，于接种24 h后镜下观察细胞贴壁，然后进行不同处理，分为4组：①对照组：未接受药物和照射处理；②药物组：加入塞来昔布，使其终浓度为25 μmol/L；③单纯照射组;④联合组：加药2 h后进行照射。细胞照射：医用直线加速器的6 MV-X射线照射，机架角180°,射野25 cm×24 cm，剂量率200 cGy/min，吸收剂量4 Gy。照射时将培养瓶的细胞面朝下，周边以封口膜封口，以保证细胞不被污染，培养瓶上做好分组标记，瓶上下垫一块1.5 cm厚的等效有机玻璃板，放疗源到有机玻璃板面的距离为100 cm，4 Gy等中心照射后,继续培养受照细胞。

1.2.4 细胞周期和细胞凋亡率的检测 处理48 h后收集细胞。收集过程：用0.25%胰蛋白酶(不含EDTA)将细胞消化成单细胞悬液，2 000 r/min离心5 min，弃上清，冷PBS洗涤2次后用500 μL PBS重悬，收集细胞数目约(1～5)×105个，加入预冷的70%冰乙醇1 ml，边加边用手轻微震荡混匀，-20℃固定过夜。检测时用冷PBS洗涤2次后，分别加入细胞周期试剂盒中的RNA酶和PI，按照说明书的步骤操作后，将样品经300目滤网过滤，应用流式细胞仪专用的试管收集标本，1 h内上机检测，并对细胞周期进行分析，实验重复3次。细胞凋亡检测时收集(1～5)×105个细胞，按照说明书进行操作。

1.3 统计学方法

应用SPSS16.0统计软件对数据进行方差统计学分析。

2 结果

2.1 细胞增殖的检测

MTT实验结果显示，各浓度塞来昔布对huh-7细胞增殖均有明显抑制作用，而且随着药物浓度增高和作用时间延长，抑制率升高，表明其抑制作用具有时间及药物浓度的依赖性(表1)。且塞来昔布从12.5 μmol/L至75 μmol/L，在同浓度下，作用72 h时抑制率明显高于作用24、48 h，差异有统计学意义(P<0.05)。

表 1 MTT 法测定塞来昔布对huh-7肝癌细胞生长的抑制作用

2.2 细胞凋亡检测

流式细胞仪检测结果发现：huh-7细胞的自发凋亡率极低，药物组凋亡率显著高于对照组，提示此浓度的塞来昔布促进huh-7细胞凋亡；放疗组凋亡率较对照组明显提高，表明放疗能够诱导凋亡；联合组凋亡率高于对照组，放疗组与药物组凋亡率比较，经统计学处理有显著性差异，见表2。

表 2 作用48 h后各组huh-7细胞凋亡率情况

▲为与对照组比较，P<0.05；○为与药物组比较，P=0.000；●为与放射组比较，P=0.000

2.3 细胞周期检测

流式细胞仪检测结果发现，各组均出现大小不一的凋亡峰，与对照组比较，药物组G0/G1期细胞比例增大，S期细胞比例减小，而 G2/M变化不大；照射组G0/G1期细胞比例增大，S期细胞比例减小，而G2/M细胞比例增大；联合组与药物组比较，G0/G1期细胞比例减小，S期细胞比例增大，而G2/M期细胞比例增大；联合组与放疗组比较，G0/G1期细胞比例减小，S期细胞比例减小，而G2/M期细胞变化不大(表3)。

表3 作用48 h后各组 huh-7细胞周期情况

3 讨论

有报道显示[1]，COX-2在肝癌组织中表达，提示COX-2可能是肿瘤防治的1个新靶点[2]。塞来昔布(celecoxib)是用于临床的COX-2选择性抑制剂，本研究发现，用不同浓度塞来昔布作用于肝癌细胞株huh-7细胞后，对细胞生长增殖有明显抑制作用，并且随着浓度的增高,作用时间的延长，这种抑制作用更明显，呈一定的剂量时间依赖关系，因此，塞来昔布有可能对肝癌细胞的发展有抑制作用。

流式细胞术检测示，塞来昔布与放疗均诱导凋亡，并且塞来昔布联合放疗对细胞凋亡有协同作用，提示塞来昔布有提高放疗敏感性，与冯文峰等研究结果相符[3]。流式细胞术检测示塞来昔布作用时,G1期受到

阻滞,阻滞细胞进入S期,从而抑制细胞增殖，与以往文献报道的[4]相符。照射时G2期发生明显阻滞与夏景光等[5]的研究结果相符。塞来昔布使对放疗不敏感的S期细胞减少，影响细胞DNA的修复，可能是其放疗增敏机制之一，具体机制需进一步研究。

综上所述，塞来昔布能提高人肝癌细胞株huh-7放疗敏感性作用，其作用可能是通过协同诱导细胞凋亡、改变细胞周期时相分布等机制来实现的。

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