5-氮杂-2’-脱氧胞苷对人前列腺癌裸鼠移植瘤生长及雄激素受体表达影响的研究

王晓路 刘桂珍 黄立嵩 陈红岩 王东彬 张 勇 黎 玮

前列腺癌是中老年男性最常见的肿瘤之一，晚期雄激素非依赖性前列腺癌是治疗的难点。该病的发病原因迄今仍不十分清楚。雄激素在前列腺的生长、转移与分化中起决定性作用，而其中雄激素受体(androgen receptor，AR)是雄激素发挥作用的中心环节。5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dC)是1种DNA甲基转移酶抑制剂，能够特异抑制DNA甲基转移酶1、3a、3b的活性，从而降低基因组DNA甲基化水平[1]。5-Aza-dC能够抑制肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞凋亡，但5-Aza-CdR是否对前列腺癌细胞中雄激素受体(androgen receptor，AR)的表达有影响目前研究较少。本研究以人雄激素依赖性前列腺癌LNCaP细胞株为研究对象，建立裸鼠背部皮下移植瘤模型，检测5-Aza-CdR对前列腺癌肿瘤的生长抑制作用及对AR基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

人雄激素依赖性前列腺癌细胞株LNCaP细胞购自中国医学科学院细胞中心，RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司；5-AZA-CdR购自美国Sigma公司，溶于二甲基亚砜(DMSO)中制备成10 mg/ml的母液，-80℃储存。6周龄雄性BALB/c裸鼠，体量18～20 g，购于中国医学科学院实验动物研究所。小鼠游离性前列腺特异性抗原(free prostate specific antigen，FPSA) ELISA试剂盒购自美国R&D公司。引物由上海生工生物工程有限公司合成。总RNA抽提试剂TRIZOL购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自TaKaRa公司，SYBR Green PCR Master Mix购自Toyobo公司。荧光定量PCR仪为ABI公司的7900实时荧光定量PCR仪。AR抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人前列腺癌LNCaP细胞培养于含10%的胎牛血清和抗生素的RPMI 1640培养基中，置37℃、饱和湿度和5%CO2孵育箱中培养。当细胞处于对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化后传代。

1.2.2 动物实验动物移植瘤模型的建立 当细胞处于对数生长期时，用胰酶消化后收集，用生理盐水洗3次，制成单细胞悬液，台盼蓝染色计数，调整细胞浓度为5×107个/ml，每次取0.1 ml，与细胞基质Matrigel混合后，皮下注射裸鼠的肋腹部，待肿瘤体积长至为300 mm3时，将LNCaP荷瘤裸鼠随机分成2组，每组10只。治疗组给予5-Aza-CdR、0.25 mg/kg腹腔注射，每2天给药1次。对照组予生理盐水腹腔注射，每3天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，计算肿瘤体积(长径×短径2×0.5)，绘制移植瘤生长曲线。观察24 天后，摘眼球取血，离心取上清检测血清PSA水平。处死所有裸鼠，取出肿块测量肿瘤重量，计算抑瘤率，抑瘤率(%)=(对照组平均瘤重-5-Aza-CdR组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100%。用手术刀把瘤块分成两部分，一部分用于抽提RNA，另一部分用于抽提蛋白质。

1.2.3 实时定量PCR检测AR mRNA的表达水平 采用Trizols法提取肿瘤组织总RNA(按说明书操作)，紫外分光计鉴定RNA的浓度和纯度，取比值为1.8～2.0的RNA进行反转录。以合成的cDNA为模板，进行real time PCR检测。AR上游引物： 5’-CATCCTGCTCAAGACGCTTC-3’；下游引物：5’-CACAGAGATGATCTCTGCCA-3’。GAPDH上游引物：5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’； GAPDH下游引物：5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’。反应步骤如下：95℃ 5 min；40个PCR循环(95℃ 10 s；60℃ 20 s；72℃ 30 s)。数据采用2-△△Ct法分析[2]。

1.2.4 WesternBlot检测AR蛋白质的表达水平 肿瘤组织用冰冷的PBS 液冲洗3次，加RIPA 细胞裂解液裂解细胞并提取总蛋白，BCA法定量总蛋白，进行SDS-PAGE(5% 浓缩胶，10% 分离胶)，各泳道上样量为50 μg。取下凝胶将蛋白转印至硝酸纤维素膜，用PBST(PBS-Tween20)溶液洗涤10 min 后， 加5%脱脂奶粉封闭2 h； 用PBST 洗涤2 次，5 min/次；加1∶1 000 稀释的抗AR抗体，4 ℃培育过夜，PBST 洗涤3 次，10 min/ 次；加1∶2 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，PBST 洗涤3 次，10 min/ 次；加化学超敏发光试剂曝光于胶片上，应用Totallab 图像分析软件进行蛋白条带灰度值测定，以目的条带的灰度值/GAPDH 条带的灰度值，该比值表示AR蛋白的相对表达量。实验重复3 次。

1.3 统计学分析

应用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5-Aza-CdR对LNCaP人前列腺癌裸鼠移植瘤生长的影响

LNCaP细胞裸鼠皮下接种6周后,肉眼可见米粒大小的肿瘤，8周后移植瘤平均体积约为300 mm3左右。给予5-Aza-CdR治疗后，裸鼠肿瘤体积逐渐增大，至治疗后的第14天，该组肿瘤增长速度较对照组明显变缓，至治疗后的第24天，对照组肿瘤体积从最初的(278±21)mm3增大到(1 867±195)mm3，5-Aza-CdR治疗组肿瘤体积从治疗初的(294±42)mm3增大到(982±83)mm3，肿瘤生长受到抑制，差异有统计学意义(P<0.01)(图1)。第24天实验结束时，5-Aza-CdR治疗组移植瘤重量与对照组比较明显下降，5-Aza-CdR组肿瘤重量为(796±178)mg，对照组为(1 267±252)mg，抑瘤率为37.2%，差异有统计学意义(P<0.01)(图2)，说明5-Aza-CdR对前列腺癌LNCaP裸鼠移植瘤的生长具有显著抑制作用。

图1 5-Aza-CdR对LNCaP人前列腺癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用

2.2 5-Aza-CdR对LNCaP人前列腺癌裸鼠血浆PSA水平的影响

5-Aza-CdR作用24天后，LNCaP荷瘤裸鼠血清FPSA浓度为(40.25±13.3)ng/mL，对照组FPSA浓度为(79.7±13.2)ng/mL，差异有统计学意义(P<0.01),见图2。

2.3 5-Aza-CdR对LNCaP裸鼠移植瘤中AR基因表达的影响

应用real time PCR，检测肿瘤组织中AR在mRNA水平上的表达，结果发现5-Aza-CdR组AR表达水平显著降低，是对照组的0.5倍，差异有统计学意义(P<0.01)。应用Western Blot法，检测了AR在蛋白质水平上的变化，同样发现5-Aza-CdR组AR表达水平显著降低，定量比较灰度值，5-Aza-CdR组是对照组的0.4倍，差异有统计学意义(P<0.01),见图3。

3 讨论

前列腺癌是西方国家男性泌尿生殖系常见的恶性肿瘤。2010年美国前列腺癌居男性癌症发病率第1位，是男性癌症死亡的第2位。我国前列腺癌发病率虽低于欧美国家，但近年随着人口老龄化、生活习惯的改变以及体格检查的逐渐普及，前列腺癌的发病率也呈上升趋势，已位居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第3位。前列腺癌具有雄激素依赖性，抗雄激素治疗至少对80%的晚期前列腺癌有效，但绝大多数患者会在短期内发展为雄激素非依赖性前列腺癌，缺乏有效的治疗方法。

大量研究证实，在前列腺癌的多步骤、多阶段的发生及发展过程中存在DNA甲基化水平和模式的紊乱[3，4]。一般来说，肿瘤细胞基因组整体DNA甲基化水平降低，但在某些基因的启动子区存在甲基化水平增高现象，后者可导致某些抑癌基因的表达沉默，进而参与肿瘤的发生发展。 5-Aza-dC是DNA甲基转移酶的抑制剂，能够特异抑制DNA甲基转移酶(DNMT)的活性，从而降低DNA甲基化水平。2006 年，5-Aza-CdR 已被美国食品药品管理局批准为治疗骨髓功能异常和白血病的药物进入临床使用，通用名为地西他滨(Decitabine)[1，5，6]。Thibault等[7]和Momparler等[8]分别对一些前列腺癌和肺癌患者在临床上试用5-Aza-dC治疗时，发现其对部分患者肿瘤有抑制作用，且延长了部分晚期肿瘤患者的生存时间。本实验中，我们发现5-Aza-CdR对人前列腺癌移植瘤有明显的抑制作用。从裸鼠移植瘤的生长曲线可以看出，从腹腔注射5-Aza-CdR的第14天开始，肿瘤的增长速度相对于对照组明显减缓，肿瘤的生长受到抑制。至5-Aza-CdR治疗后的第24天观察结束时，5-Aza-CdR治疗组肿瘤重量显著下降，抑制率约为40%。该治疗组裸鼠血清PSA浓度也显著下调，说明5-Aza-CdR在抑制前列腺癌移植瘤生长的同时，降低了血中PSA的水平。PSA是反应前列腺癌进展状况的特异性很强的肿瘤标记物。肿瘤在形成生长过程中持续稳定地分泌PSA，且其分泌量随肿瘤生长而上升。本实验中5-Aza-CdR治疗组中裸鼠血清中PSA水平与移植瘤体积均下降，两者具有正相关关系，提示PSA可以作为潜在的评价5-Aza-CdR药物对前列腺癌治疗效果的指标。

雄激素受体(androgen receptor，AR)介导的信号通路在前列腺癌的进展过程中扮演着重要的角色[9]。AR不但在雄激素依赖性前列腺癌中具有重要作用，在雄激素非依赖性前列腺癌中也具有关键作用。潘寿华[10]及甘道举[11]均证实，我国前列腺癌患者发生雄激素非依赖性转变后并没有出现AR表达的降低，反而其表达明显上升。AR表达及转录水平的升高，使AR对低水平的雄激素敏感性增强，导致癌细胞在极低浓度的雄激素环境下仍能无限制增殖，这可能是发生雄激素非依赖性转变的重要机制[12]。可见，AR在前列腺癌的进展中发挥着重要的作用，是治疗前列腺癌的重要靶标，采用或设计新型AR拮抗剂(如AR反义核酸、肽或小分子等)减弱AR表达及降低AR转录，已成为潜在的治疗晚期雄激素非依赖性前列腺癌的有效方法[13，14]。5-Aza-CdR药物对AR表达的影响，已有的研究结果还没有一个明确的结论。Sasaki 等[15]在38例前列腺癌病理组织中发现了3例组织中AR启动子区高甲基化，且均处于癌症晚期，而正常前列腺组织的AR启动子均是非甲基化状态，由此推断AR启动子区甲基化可能是前列腺癌晚期的一个事件。Jarrard等[16]证实在LNCaP细胞中，AR表达水平高，AR的启动子区呈现非甲基化状态。

图2 5-Aza-CdR对LNCaP人前列腺癌裸鼠肿瘤体积和血清PSA的影响

图3 5-Aza-CdR对LNCaP人前列腺癌裸鼠肿瘤内AR表达水平的影响

本研究首次报道，5-Aza-CdR能够显著降低前列腺癌移植瘤中AR在转录水平和蛋白质水平上的表达。由于AR的启动子区DNA呈去甲基化状态，故5-Aza-CdR不是通过影响AR启动子区的甲基化程度来改变AR的表达水平。至于5-Aza-CdR是通过何种途径降低AR表达水平的，AR的表达降低是5-Aza-CdR抑制LNCaP细胞增殖的原因还是结果，我们都将在今后的研究中继续深入地探索。由于AR对判断前列腺癌生物学行为有参考价值，故其可作为5-Aza-CdR对前列腺癌疗效判断的参考指标。

本研究证实，5-Aza-CdR对LNCaP前列腺移植瘤生长的影响具有明显抑制作用，能够显著减弱AR基因的表达，提示该去甲基化药物可能成为治疗激素或非依赖性前列腺癌可行和有价值的药物。尽管DNA甲基化酶抑制剂对临床上肿瘤的治疗取得了较大的成绩，但DNA甲基化抑制剂缺乏特异性，可能在防止一些癌症发生的同时，也会造成基因组的不稳定并增加其他组织发生癌症的风险。从临床患者和相关的动物实验以及我们的研究发现，单独应用5-Aza-dC 治疗前列腺癌的效果并不十分显著，可以尝试着联合内分泌或是化学疗法，通过降低肿瘤细胞基因组DNA 甲基化水平及AR的活性，为其他药物发挥更好疗效提供一个有益的细胞生物学背景。

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