酵母菌对发酵乳质构和蛋白的影响

李先胜，姜铁民，陈历俊,

(1.大连工业大学，辽宁大连 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085)

酵母菌对发酵乳质构和蛋白的影响

李先胜1，姜铁民2，陈历俊1,2

(1.大连工业大学，辽宁大连 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085)

探讨了酵母菌对酸奶蛋白和质构的影响。添加酵母菌没有对酸奶的质构造成显著性的影响，添加酵母菌的样品没有产生更多种类的多肽，但是氨基氮和游离氨基酸质量浓度下降，这可能是酵母菌与乳酸菌之间存在对营养物质竞争利用的原因。

质构；多肽；氨基氮；氨基酸

0 引言

在乳制品发酵过程中乳酸菌发酵占主导地位，但在亚洲、东欧、非州等传统发酵乳制品，如Kefir、Koumiss、Airag、Amasi、Cheeses产品中，酵母菌和乳酸菌起着同样重要的作用，酵母能够为产品带来期望的香气和风味[1]。近年来，不断发现酵母菌作为附属发酵剂对乳制品发酵和成熟过程中的风味影响、抑制有害菌的生长及对人体的潜在益生功能等[2-4]。

酵母菌产生的二氧化碳会破坏凝乳，但二氧化碳能促进乳酸菌的活性，同时也能有效抑制有害微生物的生长，延长有害微生物的生长周期[5]。C.zeylanoides、K.marxianus、Yarrowia.lipolytica、Debaryomyces hansenii、Geotrichum candidum这些酵母菌对蛋白质有很强的水解作用[6]。

本文选用传统发酵乳制品中常见的酵母菌Kluyveromyces marxianus和Saccharomyces cerevisiae，探讨酵母菌对酸奶质构和蛋白的影响，为开发新型发酵乳制品提供理论支持。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

酵母菌：马克思克鲁维酵母和酿酒酵母，乳酸菌（丹尼斯克直投菌种YO-MIX611）：嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。

1.1.2 材料与试剂

脱脂奶粉，Whatman定量滤纸NO.1，3 ku超滤离心管，乙腈，三氟乙酸，其他试剂均为分析纯，邻苯二甲醛试剂：准确秤取40 mg的OPA溶解于1 mL甲醇中，加入100 μL β-巯基乙醇、0.95 g四硼酸钠、0.5 g SDS，溶解后定容50 mL，现用现配，AccQ Tag Ultra化学包。

1.1.3 仪器

离心机，质构仪（TA.XT.Plus），C-18反相柱（Venusil ASB C18 4.6*250 mm/5 um），双光束紫外可见分光光度计（Cintra20），高效液相色谱仪（LC10Avp），超高效液相色谱仪（ACQUITY），氨基酸分析色谱柱（AccQ·Tag Ultra色谱柱2.1 mm×100 mm，1.7 μm），pH计。

1.2 方法

1.2.1 酸奶的制作

将酵母菌和乳酸菌对数值分别以5.3 mL-1和6.3 mL-1的初始浓度接种到灭菌（110℃，10 min）的120 g/ L的脱脂奶中，于30℃下发酵，pH值降低至4.6时结束发酵，置于4℃冰箱中保存。

1.2.2质构仪程序设定

测定前下降速度为2 mm/s，测定速度为1 mm/s，测定距离为30 mm，测定后速度10 mm/s。采用A/BE探头，直径35 mm。测定前用1 kg砝码进行质构仪较正。

1.2.3 氨基氮质量分数通过OPA法测量

取一定量的凝乳，置于研钵中，研磨成细小颗粒后用手持均质机均质2 min。用浓度为1 mol/L盐酸调pH值至4.6，室温下静置30 min，在3 000 g离心30 min。上清液（pH46可溶性部分）用Whatman定量滤纸（NO.1）过滤，滤液保存于-20℃待用。

取50 μL上清液加入1 mL邻苯二甲醛试剂中，室温下计时反应2 min，340 nm处测定吸光度。氨基酸标准曲线的制作：配制质量浓度为1 g/L的亮氨酸溶液，稀释后质量浓度分别为50，100，200，300，400和500 mg/L的标准溶液系列，按照上述方法测定吸光度，制作标准曲线，计算样品中氨基氮的质量浓度。

1.2.4 氨基酸质量分数的测定

将上清液pH值调至8.2～10之间，用3 ku的超滤离心管进行超滤，再用AccQ Tag Ultra方法进行氨基酸的柱前衍生，具体方法如下:(1)将样品、AccQ·Tag Ultra硼酸盐缓冲剂和中和试剂添加到完全回收样品瓶中。(2)加入20 μLAccQ·Tag Ultra试剂，立即涡旋混合几秒钟,等待1 min。(3)将样品瓶置于55°C下加热10 min。液相检测器、梯度洗脱程序和样品管理器设置如表1-表3所示。流动相A为洗脱液A1，流动相B为洗脱液B。

表1 PDA检测器参数

表2 UPLC梯度洗脱程序

1.2.5 反相色谱法检测pH4.6可溶部分多肽的变化

取保存的pH值为4.6上清液，用0.22 μm的膜过滤后，用于液相分析。液相分析条件：采用C-18柱，柱温为35℃。液相条件：溶剂A为体积分数0.1%的TFA水溶液；溶剂B为体积分数0.1%的TFA乙腈溶液，流速为0.8 mL/min，检测波长为214 nm。上样量为10 μL。梯度洗脱程序如表4所示。

表3 样品管理器参数

表4 RP-HPLC梯度洗脱程序

2 结果分析

2.1 质构的变化

酵母菌产生的二氧化碳会破坏凝乳，但传统发酵乳制品中乳清是要排出的，发酵过程从产生的气体破坏凝乳，这有助于乳清的排出[7]。发酵初期酵母菌会通过有氧呼吸消耗掉脱脂奶中溶解的氧气，使乳酸菌的产酸速度加快，从而增加凝乳的硬度[8]。表5为酸奶的质构。

由表5可以看出，不同酵母菌对酸奶的硬度、稠度、黏度和黏聚性均有一定的影响，添加马克思克鲁维酵母和酿酒酵母的样品在硬度、稠度、黏度和黏聚性上均有所增加,但没有发生显著性的增加（P＜0.05）。说明酵母菌的添加没有对酸奶的质构产生显著性的影响。

2.2 多肽的变化

C18色谱柱能使分子量小于5 000 u的多肽达到较好的分离效果，出峰时间越晚，多肽的相对疏水性越强。图1为pH4.6-SN液相分析结果。

由图1可以看出，pH值为4.6可溶性多肽是由多种不同极性的肽段组成，脱脂奶经发酵后多肽的种类增加。添加酵母菌样品的色谱图与未添加酵母菌样品的色谱图基本一致，说明酵母菌的添加没有增加多肽的种类，酸奶在发酵过程中，起主要作用的是乳酸菌。

2.3 氨基氮质量浓度的变化

氨基氮主要包括一些小肽和游离氨基酸，它们对酸奶风味产生重要作用。质量分数为12%的TCA可溶性肽是小于7肽的小肽。发酵剂的蛋白酶和肽酶对12% TCA可溶性氮贡献较大。采用邻苯二甲醛分光光度法测定12%TCA可溶性组分中氨基氮的质量浓度结果如表6所示。

表5 酸奶的质构

表6 氨基氮质量浓度

由表6可以看出，酵母菌和乳酸菌对脱脂奶进行发酵后的样品，与未添加酵母菌的样品相比氨基氮质量浓度有了一定程度的下降，其中添加酿酒酵母菌样品的氨基氮含量显著下降（P＜0.05）。这可能是酵母菌和乳酸菌之间存在营养物质竞争利用的原因。

2.4 游离氨基酸质量浓度的变化

游离氨基酸是影响发酵乳制品风味的重要组成成分，其中许多小肽的风味是由其末端的氨基酸决定的；由于高质量浓度的游离氨基酸对感官有促进作用，总游离氨基酸质量浓度与良好风味的提高密切相关[9]；其中芳香族氨基酸、支链脂肪酸和甲硫氨酸是风味化合物的主要前体物质，特别是甲硫氨酸能提供一种良好的黄油味和奶香味[10]。陈历水研究表明，酵母菌单独发酵后牛乳的游离氨基酸质量浓度有所增加，酵母菌能分泌一定量的蛋白酶、肽酶或者氨基转移酶，通过这些酶对牛乳中的蛋白质进行水解得到了更多的游离氨基酸[11]。

酵母菌和乳酸菌对脱脂奶进行发酵后的样品，与未添加酵母菌的样品相比总的游离氨基酸含量有了一定程度的下降，分别从272.36 mg/L下降到218.67 mg/L（马克思克鲁维酵母）和150.84 mg/L（酿酒酵母）。单个游离氨基酸含量也发生了变化，如蛋氨酸从2.28下降到1.74 mg/L（马克思克鲁维酵母）和0.62 mg/L（酿酒酵母）；脯氨酸从67.75 mg/L下降到55.33 mg/L（马克思克鲁维酵母）和54.99 mg/L（酿酒酵母）；异亮氨酸从5.11 mg/L下降到3.44 mg/L（马克思克鲁维酵母）和2.08 mg/L（酿酒酵母）。添加酵母菌后氨基酸的质量浓度有所下降，这可能是酵母菌与乳酸菌之间存在对营养物质竞争利用的原因。

3 结论

酵母菌没有对酸奶的硬度、稠度、黏度和黏聚性产生显著性的影响，添加酵母菌样品与未添加酵母菌样品的pH4.6上清液相比，没有产生更多种类的多肽，添加酵母菌的样品的氨基氮含量有所下降，其中添加酿酒酵母样品的氨基氮质量浓度显著下降（P＜0.05），添加酵母菌样品的氨基酸质量浓度有所下降，这可能是酵母菌与乳酸菌之间存在对营养物质竞争利用的原因。

表7 发酵酸乳游离氨基酸质量浓度mg/L

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Influence of yeasts on protein and texture of fermented milk

LI Xian-sheng1，JIANG Tie-min2，CHEN Li-jun1,2
（1.Dalian Polytechnic University,Dalian 116034，China;2.Beijing Sanyuan Foods CO.Ltd.,Beijing 100085，China）

The influence of yeasts on yogurt protein and texture were investigated.The effect of yeasts on texture of yogurt was not significant. The samples added yeasts did not produce more peptide.The content of amino nitrogen and free amino acid were decreased.The reason may be that yeasts and LAB exist nutrient competition.

texture；polypeptide；amino nitrogen；amino acid

TS252.1

A

1001-2230（2012）05-0030-04

2012-02-14

国家科技部“十一五”支撑计划（2009BADB9B06），国家“863”计划(2011AA100903)，北京市科技计划(D10110504600000)。

李先胜（1984-），男，硕士研究生，从事食品微生物方面的研究。

陈历俊