杭州地区原料奶中嗜冷菌的分离鉴定

吕元，叶兴乾

（1.浙江经贸职业技术学院，杭州 310018；2.浙江大学生物系统工程和食品学院，杭州 310029）

杭州地区原料奶中嗜冷菌的分离鉴定

吕元1，叶兴乾2

（1.浙江经贸职业技术学院，杭州 310018；2.浙江大学生物系统工程和食品学院，杭州 310029）

以杭州地区牧场的原料奶为实验对象，对原料奶受嗜冷菌污染情况进行调研，并对其中的嗜冷菌进行分离鉴定，确定革兰氏阴性嗜冷菌占绝大部分，其中荧光假单胞菌、鲁氏不动杆菌、阪崎肠杆菌为优势嗜冷菌种，为进一步研究出一种快速检测原料奶嗜冷菌的方法奠定理论基础。

原料奶；嗜冷菌；调研；分离鉴定；优势菌群

0 引言

食品微生物领域中嗜冷菌是指：0～7℃下能够生长并在7～10 d内产生可见菌落的一类微生物。

原料奶在低温冷藏时会受到嗜冷菌的污染。嗜冷菌大量繁殖并产生耐热的脂肪酶和蛋白酶。这些酶经过高温灭菌阶段还会有少量残留，在成品奶制品储藏过程中继续分解其中的脂肪和蛋白质，导致产品品质发生变化。而传统的嗜冷菌检测方法耗时长，不能及时的反映原料奶受嗜冷菌污染的程度。要控制原料奶的嗜冷菌污染，就要研究出原料奶中嗜冷菌在低温冷藏时的生长规律，确定其中的优势菌群。

本文对杭州地区原料奶中的嗜冷菌进行分离鉴定，并明确了不同时期原料奶中嗜冷菌的优势菌群，为生产上有效控制嗜冷菌数量、减少其对乳制品的危害、提高乳品质量和安全性提供理论依据。

1 实验

1.1 原料

本试验供试原料为产自杭州周边地区10个分散小牧场的原料奶，取样时间为2008年10月至2009年8月，每月取样1次。

1.2 主要试剂与仪器

培养基：葡萄糖1.0 g，酵母提取物2.5 g，脱脂奶粉1.0 g，胰蛋白胨5.0 g，琼脂粉10～15 g，蒸馏水1 000 mL，pH值为6.8～7.0，蛋白胨，革兰氏染色液。

仪器：洁净工作台，恒温水浴锅，高压灭菌锅，电热烘箱，生化培养箱，千分之一天平，光学显微镜。

1.3 方法

1.3.1 样品的采集

从2008年10月至2009年8月，每月到10个牧场取样1次，无菌取样50 mL于经辐照灭菌的无菌离心管中，每个样品取3管，并作好标记。将取好的样品置于低温保温箱中，送回至实验室于4℃冰箱中保存。

1.3.2 培养基的制备

按培养基成分表中的成分比例称量各组分，用蒸馏水配成溶液，置于高压灭菌锅内灭菌（121℃，20 min）。将灭好菌的培养基冷却至45℃左右时，倒入无菌平板（经180℃，2 h干热灭菌）中留用。

1.3.3 无菌蛋白胨水的制备

称量10 g蛋白胨溶于1 000 mL蒸馏水中，再分装于试管和广口瓶中，每支试管量取9 mL，广口瓶225 mL，121℃，20 min灭菌。

1.3.4 样品稀释

取将10个牧场的原料奶样品，编号1-10，并将每一份原料奶样品进行梯度稀释。以1号原料奶样品为例：取原料奶样品25 mL，加入225 mL的1%蛋白胨水稀释液中，稀释至10-1倍；从10-1倍稀释液中取1 mL，加入9 mL稀释液中，稀释至10-2倍；按此方法将样品稀释至10-8。2-10号样品的稀释同1号样品。

1.3.5 接种与培养

以1号原料奶样品为例，先取10-4，10-5，10-6，10-7稀释度，每个稀释度取1 mL样液均匀涂布在已倒好的培养基的平板中，每个稀释度做3个平行样，置于7℃的生化培养箱中培养10 d。同时做空白对照样。2-10号按此方法进行。

1.3.6 嗜冷菌的分离纯化

仔细观察平板中各菌的菌落形态，观察菌落大小、形状、色泽、色素产生、表面光滑程度、边缘整齐度，并结合各菌种的革兰氏染色情况进行嗜冷菌的分离。将不同菌落形态的嗜冷菌菌落编号并进行纯化，重复纯化3次。

1.3.7 样品送检

将样品送至省人民医院微生物检测中心，鉴定各菌种的归属。鉴定仪器为法国biosMerieumx(生物梅里埃）公司的VITEK系列全自动微生物分析仪。

2 结果和讨论

2.1 分离出的嗜冷菌革兰氏染色结果和菌落形态

从10个牧场的3个季度的原料奶样品中，一共分离出90株菌落形态各异的嗜冷菌，经过省人民医院微生物种属鉴定，确定这90株菌分别归属于16个种属的嗜冷菌。表1列出的是这16个种属的嗜冷菌革兰氏染色结果以及菌落形态。

2.2 嗜冷菌生理生化反应图谱

经省人民医院微生物检测中心检验，从鉴定菌种的生理生化图谱可知：从10个牧场的原料奶样品中共分离到90株嗜冷菌纯菌种分属于16个种属，分别为荧光假单胞菌16株、阪崎肠杆菌16株、鲁氏不动杆菌15株、乳杆菌8株、少动鞘氨醇单胞菌6株、藤黄微球菌4株、溶藻阮酸弧菌4株、大肠杆菌4株、铜绿假单胞菌3株、普通变形杆菌3株、蜂房哈夫尼菌2株、肺炎克雷伯菌2株、皮氏罗尔斯顿菌2株、亲水气单胞菌2株、中间肠杆菌2株和嗜热地衣芽孢杆菌1株。其中13个种属77株嗜冷菌是革兰氏阴性菌，3个种属13株嗜冷菌为革兰氏阳性菌。由此可见在杭州地区的原料奶中，革兰氏阴性嗜冷菌占嗜冷菌的绝大部分，且荧光假单胞菌、阪崎肠杆菌和鲁氏不动杆菌是原料奶中主要的优势菌，这也和国内外的一些报道相吻合。

表1 分离出嗜冷菌的革兰氏染色结果及菌落形态描述

此前的研究人员也从原料奶中分离出了嗜冷菌属，结果显示：由于不同地区由于气候条件的差异，其原料奶中微生物的菌相构成各不相同；同样，同一地区，不同季节，原料奶中的微生物组成也不同。例如，刘敏以产自内蒙古的原料奶为样本，分离出来27株嗜冷菌，其中革兰氏阴性嗜冷菌占大部分。分离出来的27株嗜冷菌中气单胞菌属7株，节杆菌属4株，黄杆菌属3株，巴斯德氏菌属3株，乳球菌属2株，变形菌属1株，短杆菌属1株，微球菌属1株，片球菌属1株，明串珠菌属1株和待定菌属4株[2]，其中气单胞菌属和节杆菌属是优势的嗜冷菌群。而以吴石金以杭州燕牌乳业3月份至10月份的原料奶为样本，分离出来16株嗜冷菌，其中10株为假单胞菌，4株为微球菌[3]，其中假单胞菌是优势的嗜冷菌群。所以说研究出本地区原料奶中的嗜冷菌的菌相组成以及优势菌群对于控制本地区嗜冷菌的污染具有重要意义。

2.3 各个牧场分离出来的嗜冷菌及其数量统计

表2是对10个牧场分离出来的嗜冷菌菌属种类的统计表。

由表2可以看出，从各个牧场分离出来的嗜冷菌种类数是有所不同，但种类都比较多。荧光假单胞菌、鲁氏不动杆菌和阪崎肠杆菌在这10个牧场中均有检出。在送至省人民医院检测的90株样本中，这3种菌占了半数以上，由此可见，这3种菌是杭州地区牧场原料奶中主要的优势嗜冷菌群。

表2 各牧场分离出嗜冷菌种类统计结果

表3 不同月份各牧场中检测出来的嗜冷菌统计结果

2.4 不同月份分离出来的嗜冷菌种类及其数量统计

表3列出了2008年10月至2009年8月在各牧场原料奶中检测出来的嗜冷菌的种类。可以看出，每个月检测出来的嗜冷菌种类有所不同，但是荧光假单胞菌、阪崎肠杆菌和鲁氏不动杆菌在每个月均有检出。其他嗜冷菌都是在不同月份有检出，但是检出频率没有以上3种嗜冷菌高。图1为2008年10月至2009年各8月各季度检测出来此种嗜冷菌的牧场数量。

由图1可以看出，2008年10月至12月，在10个牧场的原料奶中共检测出嗜冷菌9种；2009年3月至2009年5月，共检测出嗜冷菌7种；2009年6月至8月共检测出嗜冷菌11种。在这10个牧场的原料奶中还检测出肠杆菌，肠杆菌可以在低温条件下生长，但其最适生长温度为37℃左右，所以在2009年6月至8月这段时间比较容易存活，污染原料奶的几率比较大。

荧光假单胞菌、阪崎肠杆菌和鲁氏不动杆菌在这3个季度均有检出，而且检出牧场数量也是最多了，也证明了这3种嗜冷菌是这一时间段杭州地区牧场原料奶中的优势嗜冷菌群。乳杆菌和藤黄微球菌这两种革兰氏阳性嗜冷菌只在少数几个月份和牧场被检测出来。可以看出杭州地区的牧场中，革兰氏阴性菌在原料奶中占有绝对的优势。

3 结论

从以上的研究中，可以得到如下结论：革兰氏阴性菌占杭州地区牧场冷藏原料奶微生物的绝大部分。荧光假单胞菌、阪崎肠杆菌和鲁氏不动杆菌是原料奶中的优势嗜冷菌群。这为进一步建立快速检测原料奶中嗜冷菌的数量提供了理论基础。

[1]MORITA R Y.Psychrophilic bacteria[J].Bacteriological Reviews, 1975，39(2)：144-167.

[2]刘敏.原料乳中嗜冷菌的分离鉴定及生物学特性的研究[D].内蒙古,内蒙古农业大学,2005.

[3]吴石金,何光华.原料乳嗜冷菌分离株微生物学特性研究[J].中国乳品工业,2005，33(8)：4-6.

[4]于美艳,苗秀芬,于桂荣.巴氏杀菌（消毒牛奶）中低温菌对产品保存期的影响[J].中国乳品工业,1996，24(1)：36-37.

Isolation and identification species of psychrophilic microorganisms from raw milk provided by the pastures in Hangzhou district

LV Yuan1,YE Xing-qian2
(1.Zhejiang Economic&Trade Polytechnic,Hangzhou,310018,China;2.Zhejiang University,Hangzhou,310029,China)

This paper focused on isolation and identification species of psychrophilic microorganisms from raw milk provided by the pastures in Hangzhou district.Most of psychrophilic microorganisms in raw milk of Hangzhou district were Gram-negative psychrophilic microorganisms. Pseudomonas fluorescens、Acinetobacter lwoffii and Enterobacter sakazakii were dominant microorganisms.All of the resalts were the basis of set up a new rapid methods for dairy industry to detect the contamination of psychrophilic microorganisms in raw milk.

raw milk;psychrophilic microorganisms;research;isolation and identification;dominant microorganisms

TS252.41

A

1001-2230（2012）03-0043-04

2011-11-25

浙江经贸职业技术学院院级科研课题《原料奶中嗜冷菌的快速检测》（11QN12）资助。

吕元(1985-)，女，研究见习员，从事食品安全方面的研究。