RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排监测急性淋巴细胞白血病患儿治疗过程微小残留白血病

李彦媚 叶铁真 赖冬波 何映谊 林慧玲

目前，随着治疗方法的进步，90%以上的儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)在诱导化疗后可获得完全缓解(CR)，并有70%～80%可获得5年持续完全缓解(CCR)。然而，仍有20%～30%患儿在缓解后复发，这与体内仍然存在形态学上无法检测的残留白血病细胞，即微小残留白血病(MRD)有关。大量研究证明，MRD是最能反映个体治疗效果和预后情况的指标之一，也是引起白血病复发的最主要原因之一。在白血病治疗过程中准确检测MRD并分析其意义，对临床追踪病情和判断预后，并据此制定更具针对性的个体化治疗方案等，具有重要意义[1]。

RQ-PCR检测免疫球蛋白(Ig)/T细胞抗原受体(TCR)基因重排是目前定量追踪ALL-MRD的可靠方法[2,3]。本研究以RQ-PCR检测[4,5]Ig/TCR基因重排，监测广州市妇女儿童医疗中心(我院)收治ALL患儿在治疗过程中MRD的变化趋势，以评价该方法在儿童ALL中的应用价值。

1 方法

1.1 纳入标准 ①2009年3月至2011年3月在我院血液肿瘤科初诊和治疗的ALL患儿；②均经骨髓细胞形态学[6]和免疫分型诊断[7]；③以广东地区儿童ALL 2008化疗协作组方案(GD2008ALL)进行危险度分型及化疗[8]；④采集的骨髓样本除用于细胞学检测外的剩余标本被用于Ig/TCR基因重排检测。

1.2 伦理审核 本研究经我院伦理委员会审核通过。

1.3 随访观测时点 以下时间点采集骨髓标本用于临床评估：①初诊时(0个月)；②诱导缓解治疗末d33(随访1个月)；③巩固治疗前(随访2个月)；④早期强化治疗前(随访4个月)；⑤维持治疗前(随访6 个月)；⑥维持治疗阶段(由维持治疗开始后每90天随访1次)。连续随访至早期强化治疗前的患儿进入分析。以上时间同时检测Ig/TCR基因重排表达量。

1.4Ig/TCR基因重排检测

1.4.1 标本处理 骨髓标本以Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞，并使用分离柱试剂盒(购自中国TRANSGEN公司)提取单个核细胞DNA。

1.4.2 PCR检测初诊患儿Ig/TCR基因重排 ①选取欧洲Biomed-1和Biomed-2研究中的12对引物(表1)，以PCR扩增每例初诊ALL患儿骨髓标本的IgH、Igκ、TCRγ和TCRδ基因重排[9,10]。PCR反应体系包括PCR MixBuffer (10×)5.0 μL(日本TOYOBO公司)、上下游引物(由广州英骏生物公司合成)各70 pmol、模板DNA 100 ng，加去离子水至终体积50 μL。PCR反应条件：94℃ 7 min；94℃30 s，60℃ 45 s，72℃ 90 s，共35个循环；72℃ 10 min，4℃保存。每次反应均设阳性对照(Jurkat细胞或Reh细胞DNA)、阴性对照(正常人DNA)和空白对照(以双蒸水取代模板DNA)；②1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

表1 PCR检测Ig/TCR基因重排的引物序列

Tab 1 Sequence of primers forIg/TCRgene rearrange-ments detection

PrimerSequenceIgHVH1/VH7-F5'-CCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGG-3'VH3-F5'-GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA-3'VH4-F5'-TCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGC-3'JH-R5'-ACCTGAGGAGACGGTGACCAGGGT-3'IgkVk1-F5'-GTAGGAGACAGAGTCACCATCACT-3'Vk2-F5'-TGGAGAGCCGGCCTCCATCTC-3'Vk3-F5'-GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG-3'Vk4-F5'-GGCGAGAGGGCCACCATCAAC-3'Kde-R5'-CCTCAGAGGTCAGAGCAGGTTGTCCTA-3'TCRδVδ2-F5'-GGACATCGAGTCATGTCAGCC-3'Dδ2-F5'-AGAAGAGGGTTTTTATACTGATGTG-3'Dδ3-R5'-AGGGAAATGGCACTTTTGCC-3'TCRγVγ1-F5'-CAGGCCGACTGGGTCATCTGC-3'Vγ2-F5'-CAGCCCGCCTGGAATGTGTGG-3'Vγ4-F5'-CTGAAATATCTATTTCCAGACCAGC-3'Jγ1.3/2.3-R5'-AATGTTGTATCTTCCGATACTTACC-3'albuminabm-F5'-GCTGTCATCTCTTGTGGGCTGT-3'abm-R5'-AAACTCATGGGAGCTGCTGGTT-3'

Notes F：forward primer；R：reverse primer，reverse primer labeled with FAM at 5′ site

1.4.3 基因扫描分析Ig/TCR基因重排产物克隆特性[10]①取上述PCR的阳性产物1 μL，加入9.5 μL甲酰胺和0.5 μL Genescan-500荧光标记分子量标准品(美国ABI公司)，置于PCR仪上反应，95℃ 2 min，4℃ 60 min，以形成异源双链DNA；②将异源双链DNA置基因扫描仪(美国ABI公司)上检测，使用仪器配置的软件分析Ig/TCR基因重排的克隆性。

1.4.4 RQ-PCR检测Ig/TCR基因重排相对表达量 ①对经上述基因扫描鉴定为单克隆的PCR产物进行测序；②将测序结果输入IMGT数据库(http://imgt.cines.fr/imgt-vquest/ share/ textes/)进行同源性比对，确定每例患儿特异的Ig/TCR基因重排序列，以此序列为MRD追踪靶目标，在Primer 3.0软件中设计特异性引物，根据IgH、Igκ、TCRγ、TCRδ基因的J片段保守序列设计探针[11]；③用正常人DNA将初诊患儿骨髓DNA(600 ng)梯度稀释至1.0×10-1～1.0×10-6浓度以建立Ig/TCR基因重排的标准曲线；以去离子水将正常人DNA梯度稀释至1 000、500、100、50和10 ng以建立内参基因albumin的标准曲线。RQ-PCR反应体系见表2，反应条件：95℃ 60 s；95℃ 15 s，60°C 60 s，共40个循环，退火温度可根据特异性引物Tm值调整。③对各观察时间标本以标准曲线计算Ig/TCR基因重排表达量。每份样本设2个复管，同时以albumin基因为阳性对照、正常人DNA为阴性对照和双蒸水为空白对照。以Ig/TCR基因重排的表达量与albumin管基因表达量之比，即Ig/TCR基因重排的相对表达量反映MRD水平。

表2 RQ-PCR反应体系(μL)

Notes NC: negative control; PC: positive control; F：forward primer；R：reverse primer

1.5 研究指标的定义 ①临床危险度：诱导治疗前按GD2008ALL方案[8]分为高危(HR)、标危(SR)和中危(IR)。②Ig/TCR基因重排表达量危险度分期：在诱导缓解治疗结束时(d33)划分危险度：Ig/TCR基因重排相对表达量<1.0×10-4为SR，～1.0×10-3为IR,≥1.0×10-3为HR；③MRD阴性：Ig/TCR基因重排相对表达量<1.0×10-4；④ CCR：经治疗获得完全缓解后，持续3～5年或更长时间无复发者。⑤复发：治疗达到缓解后发生以下任一项：a.骨髓原始细胞+幼稚细胞>0.05但<0.20，经过有效抗白血病治疗1个疗程仍未达到骨髓CR标准者；b.骨髓原始细胞+幼稚细胞≥0.20者；c.骨髓外白血病浸润者。

2 结果

2.1 一般情况 86例初诊ALL患儿进入分析，其中男52例，女34例；年龄1～13(4.3±3.0)岁；1～5岁63例，≥6岁23例；L1型50例，L2型30例，L3型6例；B-ALL 76例，T-ALL 10例； 临床危险度SR 28例，IR 40例和HR 18例。随访至2011年4月30日，随访时间1～26(14.3±7.0)个月，复发5例(5.8%)。

2.2 初诊ALL患儿Ig/TCR基因重排的总检出率 86例初诊ALL患儿中，83例(96.5%)检出1种或以上Ig/TCR基因重排，共检出209个Ig/TCR基因重排，平均每例检出2.52个。1种基因重排者占13.2%(11/83例)；同时存在2、3和4种Ig/TCR基因重排分别为34.9%(29例)、38.6%(32例)和13.2%(11例)。4种Ig/TCR基因重排的比例依次为IgH80.7%(67例)、TCRδ67.5%(56例)、Igκ55.4%(46例)和TCRγ49.4%(41例)。

2.3 初诊患儿Ig/TCR基因重排的克隆特性 83例检出Ig/TCR基因重排的病例中，根据患儿来院随访条件最大限度的依从性，61例患儿的172个Ig/TCR基因重排行基因扫描。56/61例(91.8%)可检出1种或以上单克隆性Ig/TCR基因重排；172个Ig/TCR基因重排中，单克隆性、寡克隆性和多克隆性Ig/TCR基因重排的检出率分别为58.1%(100个)、30.8%(53个)和11.0%(19个)，差异有统计学意义(P=0.000)。

2.4 随访患儿Ig/TCR基因重排相对表达量 26/56例单克隆性Ig/TCR基因重排患儿完成连续3次随访，其中22例CCR和4例复发。如表3所示，22例CCR患儿初诊时Ig/TCR基因重排的相对表达量为2.70×10-1±2.55×10-1，诱导缓解治疗结束时d33降至9.91×10-4±2.08×10-3，差异有统计学意义(P=0.000)；在巩固治疗开始前，Ig/TCR基因重排的相对表达量进一步下降至7.85×10-5±2.76×10-4，与诱导缓解结束时d33比较差异有统计学意义(P=0.036)；其后至维持治疗9个月期间，各检测时点Ig/TCR基因重排相对表达量在1.0×10-5～1.0×10-6，与相近上个随访时点比较差异均无统计学意义；在维持治疗12个月后，均未检出Ig/TCR基因重排相对表达量。

表3 22例CCR患儿不同治疗时点的Ig/TCR基因重排相对表达量

Notes m: month; 1)vsinitial; 2)vsd33; 3)compared with the last follow-up point

表4显示，4例复发患儿初诊时Ig/TCR基因重排相对表达量均>1.0×10-1；在诱导缓解治疗结束时(d33)均明显下降，处于同期CCR病例水平。例1Ig/TCR基因重排相对表达量在早期强化治疗前开始升高，其后继续升高，并一直维持在同期CCR病例的均值水平以上，至维持治疗6个月时骨髓复发，从回升至骨髓复发为8个月；例2的Ig/TCR基因重排相对表达量在诱导缓解治疗结束时(d33)至早期强化治疗前呈下降趋势，但一直高于同期CCR病例水平，至维持治疗前开始回升，在维持治疗3个月时出现骨髓复发，从回升至骨髓复发为3个月；例3和4Ig/TCR基因重排的相对表达量在巩固治疗前回升至同期CCR病例水平以上，均在早期强化前即出现骨髓复发，从回升到骨髓复发均为2个月。复发病例4经再予诱导缓解治疗后，Ig/TCR基因重排表达量降至8.66×10-4。4例患儿Ig/TCR基因重排的相对表达量开始回升至临床复发的平均时间为3.75(2～8)个月。

表4 4例复发患儿不同治疗时点的Ig/TCR基因重排相对表达量

Notes m: month; red fonts indicated relapse

2.4 临床危险度与Ig/TCR基因重排划分危险度的关系 表5显示，26例随访患儿诱导治疗结束时(d33)根据Ig/TCR基因重排相对表达量划分危险度，SR 10例(38.5%)，IR 12例(46.2%)，HR 4例(15.4%)；诱导治疗前SR 7例(26.9%)，IR 13例(50.0%)，HR 6例(23.1%)。两者分级一致11例(42.3%)，其中SR 4例、IR 5例、HR 2例。

4例复发患儿初诊时IR 3例，SR 1例；根据Ig/TCR基因重排相对表达量重新划分危险度，例3原为SR调整为IR(Ig/TCR基因重排相对表达量为8.00×10-4)，例2原为IR调整为HR(Ig/TCR基因重排相对表达量为1.20×10-3)，例1和4的分级不变。

表5 临床危险度分级与根据Ig/TCR基因重排相对表达量划分危险度分级结果(n)

Tab 5 Comparison of risk stratification by clinical data andIg/TCR(n)

Ig/TCRriskClinicalriskSRIRHRSR460IR354HR022

Notes SR: standard risk; IR: intermediate risk; HR: high risk

3 讨论

3.1 联合检测多种Ig/TCR基因重排可保证检出率 文献报道，Ig/TCR基因重排在儿童和成人ALL中均具有极高的检出率，97%以上B-ALL患者可检出1种Ig/TCR基因重排[12]。欧洲白血病治疗协作组通过Biomed-1和Biomed-2研究，已建立了PCR检测Ig/TCR基因重排的通用引物系统，该系统所使用的引物共108对，Ig/TCR基因重排的检出率达到100%。但该系统引物数量较多，不利于其临床应用。Szczepański等[13]选用Biomed-1引物系统中的25对引物检测96例初诊B-ALL患儿的IgH、Igκ、TCRδ和TCRγ基因重排，结果显示98%患儿可检出Ig/TCR基因重排。本研究初诊ALL患儿Ig/TCR基因重排的检出率达96.5%，提示通过联合检测多种Ig/TCR基因重排，既可减少引物的数量，同时又可获得较高的检出率，这可能更适合儿科临床实际，提高临床应用的可行性。

3.2 基因扫描可有效筛选出不同克隆特性的Ig/TCR基因重排 寡克隆性基因重排在儿童B-ALL中常见，其中寡克隆性IgH和TCRδ基因重排发生率为30%～40%[13]；并且不同克隆来源的基因重排在白血病治疗过程中可发生优势变化，若以寡克隆性基因重排作为MRD检测的靶目标，则可因为随访过程中靶目标的丢失，使MRD检测出现假阴性结果。因此，多个研究机构均建议初诊时应对Ig/TCR基因重排进行克隆性分析[5,11,13]，首选单克隆性基因重排作为MRD检测的靶目标。本研究采用基因扫描方法，对ALL患儿的Ig/TCR基因重排PCR产物进行克隆性分析，结果符合白血病淋巴细胞Ig/TCR基因重排的克隆特点，提示基因扫描可准确分析Ig/TCR基因重排的克隆性，有效筛选出不同克隆特性的Ig/TCR基因重排。

3.3Ig/TCR基因重排可评价疗效和判断预后 本研究22例CCR患儿的Ig/TCR基因重排相对表达量在诱导治疗后明显下降，并随着治疗时间的延长而持续下降，直至阴性。Li等[14]用RQ-PCR扩增Ig/TCR基因重排，对36例诱导缓解化疗d29的B-ALL患儿进行MRD定量检测，MRD水平≥1.0×10-3与复发显著相关(P=0.002 5)。Zhou等[15]以RQ-PCR检测284例B-ALL患儿Ig/TCR基因重排，诱导治疗结束时Ig/TCR基因重排相对表达量<1.0×10-3者5年复发风险为12%，≥1.0×10-3者为72%。Ryan等[16]分别在诱导治疗15 d、巩固治疗、强化治疗结束等时间点检测Ig/TCR基因重排相对表达量，发现以上各时点的MRD水平均与复发显著相关，尤其≥1.0×10-3者在短期内有复发倾向。本研究中4例复发的ALL患儿，复发前Ig/TCR基因重排相对表达量均已回升，从开始回升至复发的平均时间为3.75(2～8)个月，并在复发时Ig/TCR基因重排相对表达量均升至1.0×10-2以上；提示Ig/TCR基因重排相对表达量下降后又重新回升，有预示复发的意义，对此部分患儿应加强监测或调整治疗。

本研究在诱导治疗后根据Ig/TCR基因重排表达量划分危险度，15/26例与初诊时的危险度分级不一致，其中4例复发患儿诱导化疗结束时，以Ig/TCR基因重排相对表达量重新划分危险度，1例原为IR调整为HR，1例SR患儿调整为IR，即2例患儿的危险度升级。提示在诱导缓解治疗结束时，按Ig/TCR基因重排相对表达量重新划分危险度可准确地评价疗效、判断预后。

3.4 本研究的不足之处和局限性 ①由于患儿入组时间不一致，部分患儿未完成本研究设定的连续3次随访；同时部分患儿失访，导致本研究进入Ig/TCR基因重排相对表达量动态分析的样本量不多；②纳入复发患儿仅4例，因此无法按B-ALL 和T-ALL进一步分析。

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