葛根素对中波紫外线损伤HaCaT细胞的抗氧化作用*

黄绵庆，杨照新，姚茂忠，田树红，符 健

(海南医学院，海口 571101)

葛根素(puerarin)是从豆科植物野葛(pueraria lobata)的干燥根中提取的主要有效成分，其化学名称为8-β-D-葡萄吡喃糖-4′，7-二羟基异黄酮，临床上主要用于冠心病、各型心绞痛、心肌梗死、视网膜动、静脉阻塞及突发性耳聋的治疗。葛根素在体外有良好的清除氧自由基的能力[1-2]，其抗氧化作用是保护急性缺血心肌细胞的重要机制之一[3]。为了深入研究葛根素是否对氧化损伤的上皮细胞也具有保护作用，作者以人角质形成细胞(HaCaT细胞)建立中波紫外线(ultraviolet B，UVB)氧化损伤模型，研究葛根素不同处理方式对HaCaT细胞抗氧化指标的影响。

1 材料与方法

1.1细胞株 HaCaT细胞株，购自中科院昆明细胞库。

1.2仪器与试剂 MCO-15AC二氧化碳培养箱为日本三洋公司产品，MK3型酶标仪为上海赛默飞世尔仪器有限公司产品，流式细胞仪为美国Becton Dickison公司产品，紫外线测量仪为台湾先驰光电股份有限公司产品，葛根素为华北制药集团制剂有限公司产品，活性氧(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒为江苏碧云天生物技术研究所产品，超氧化物歧化酶(super oxidative dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPH-Px)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。

1.3方法

1.3.1HaCaT细胞培养 HaCaT细胞以DMEM培养，置于37 ℃和5%CO2的细胞培养箱环境生长。细胞融合至80%以上，倾去瓶中培养液，以0.05%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化细胞，1 000 r/min离心5 min后去上清液，加入培养液调整细胞浓度为5×104/mL，将HaCaT细胞接种到6孔培养板生长，取指数生长期细胞进行实验。

1.3.2HaCaT细胞分组和处理 实验设5个组，分别为阴性对照组、模型组、UVB照射前给药组、UVB照射后给药组和UVB照射前后给药组。细胞生长融合至80%时，UVB照射前给药组细胞以1.0 mg/mL葛根素孵育1 h，弃上清液后以30 mJ/cm2UVB直接照射细胞；UVB照射后给药组细胞在UVB照射后以1.0 mg/mL葛根素处理1 h；UVB照射前后给药组细胞在UVB射前后各以1.0 mg/mL葛根素处理1 h。选择1.0 mg/mL葛根素浓度，是因为课题组先前研究结果显示该浓度葛根素对HaCaT细胞无细胞毒性，并且对UVB诱导的HaCaT细胞凋亡抑制作用最佳[4]。阴性对照组不接收药物和UVB处理，模型组细胞只接受UVB照射。各处理组细胞在UVB射后24 h进行指标检查。

1.3.3检测细胞内ROS UVB照射后24 h，细胞消化和离心，以4 ℃磷酸缓冲液洗涤2次，调节细胞浓度为1×106/mL，按照ROS检测试剂盒装载DCFH-DA荧光探针，以流式细胞仪检测每万个细胞的平均荧光强度，激发波长为488 nm，荧光强度代表细胞内ROS水平。

1.3.4检测细胞内抗氧化指标 细胞在UVB照射后24 h消化洗涤，调节细胞浓度为1×107/mL，在0 ℃制备细胞匀浆，离心后将细胞上清液转移至干净试管，按照各试剂盒说明书检测T-AOC、MDA、SOD、CAT、GSH-Px水平。

2 结 果

2.1葛根素对HaCaT细胞内ROS水平的影响 照射UVB的HaCaT细胞内ROS水平显著升高，给予葛根素处理后ROS水平均下降，见图1。

2.2葛根素对HaCaT细胞内T-AOC和MDA水平的影响 与阴性对照组相比，模型组T-AOC水平明显下降，而MDA水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，UVB照射前给药组与UVB照射前后给药组HaCaT细胞内T-AOC水平下降，而MDA水平上升，差异有统计学意义(P<0.05)；UVB照射后给药组HaCaT细胞内T-AOC和MDA水平与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 葛根素对HaCaT细胞内T-AOC和MDA水平的影响

##：P<0.01，与阴性对照组比较；*：P< 0.05，**：P<0.01，与模型组比较。

2.3葛根素对HaCaT细胞内SOD、CAT、GSH-Px水平的影响 与阴性对照组比较，模型组细胞内SOD、CAT、GSH-Px水平均明显下降(P<0.01)。与模型组比较，UVB照射前给药组和UVB照射前后给药组细胞内SOD、CAT、GSH-Px水平均上升(P<0.05)；UVB照射后给药组细胞内SOD水平上升(P<0.05)，但CAT和GSH-Px水平无明显变化(P>0.05)。见表2。

表2 葛根素对HaCaT细胞内SOD、CAT、GSH-Px水平的影响

##：P< 0.01，与阴性对照组比较；*：P< 0.05，**：P< 0.01，与模型组比较。

##：P<0.01，与阴性对照组比较；**：P<0.01，与模型组比较。

3 讨 论

阳光紫外线根据波长分为UVA、UVB和UVC，UVB虽然只占其中4%，但对皮肤晒伤和皮肤癌的形成起主要作用。首先，UVB可被皮肤角质形成细胞DNA吸收，直接导致DNA损伤、癌基因和抑癌基因突变。其次，UVB可触发光氧化反应，增加细胞内ROS。ROS水平超过细胞抗氧化系统防御能力引起细胞损伤[5-6]。因此针对UVB的抗氧化剂一直是这一领域的热点。葛根素药用制剂从2003年起被SFDA批准注册，主要作为心血管治疗药物使用。虽然葛根素在心脑血管病治疗中显示抗氧化作用，但是尚未有抗紫外线氧化损伤的研究报道。

有关葛根素的大多数研究显示，葛根素能直接清除氧自由基，对多种细胞损伤具有保护作用，可减轻缺血-再灌注引起的心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞和神经细胞损伤，此外对糖尿病胰腺细胞、乙醇中毒肝细胞和阿尔茨海默病神经细胞也有很好的保护作用[3,7-13]。在抗氧化机理方面，Zhao等[14]研究显示葛根素提高乙醇损伤大鼠肝脏内SOD和GSH-Px水平，同时降低MDA水平；Wan等[15]发现葛根素可提高缺血-再灌注大鼠脑组织SOD水平并降低MDA水平。与此一致的是，本文无论预防性还是治疗性葛根素处理，均不同程度增加UVB照射细胞相关抗氧化指标和减少ROS水平。相比之下，UVB照射前后均给葛根素增加细胞内SOD、CAT和GSH-Px水平的效果更佳，而UVB照射后给葛根素处理除了增加细胞内SOD水平外，对其他指标均无影响。这表明葛根素不同处理方式影响其抗氧化能力，其中预防性结合治疗性处理效果最佳，单纯预防性处理其次，单纯治疗性处理最差。

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