喜树嫩叶中喜树碱的HPLC提取方法的选择

李红英，龙 澜，李亚杰，帅超群，程新华，黄建民，张 亮

(1.湖北省农业科学创新中心鄂西综合试验站，湖北 恩施445000;2.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000)

喜树碱(Camptothecin,CPT)是我国特有树种喜树(CamptothecaacuminateDecne)中所含的一种具有显著抗癌活性的生物碱[1-2]，其抗癌机理是通过抑制拓扑异构酶I发挥细胞毒性[3-4].相关报道已对喜树的嫩叶与成叶中喜树碱含量做了对比实验[5]，研究结果表明嫩叶中喜树碱含量明显高于成叶.而我们已经研究了同一地区不同时间采摘喜树嫩叶的含量差别，得到了湖北建始喜树嫩叶的最高含量为3.25‰.已有的喜树碱含量测定方法中均以甲醇或乙醇浸提数次的方法来提取喜树碱[6-8]，提取时间长，且不易提取完全.本实验以喜树嫩叶为原料，对喜树碱不同提取方法进行比较.

1 试剂、试药和仪器

1.1 试剂与试药

乙腈由(天津市科密欧化学试剂有限公司，色普纯)提供； 水为二次重蒸馏水；甲醇(国药集团化学试剂有限公司，分析纯)；其余试剂由均为市售分析纯；喜树碱(CPT)对照品(上海源叶科技有限公司)纯度98.5%；喜树嫩叶采集自湖北省恩施州宣恩县.

1.2 仪器

Waters 2695分离单元 Waters2996二极管矩阵检测器;Waters色谱柱恒温箱Empower2数据处理系统，Al204电子天平;KQ-50E型超声波清洗器，SZ-93型自动双重纯水蒸馏器.溶剂过滤器等实验室常规仪器.

2 方法与结果

2.1 含量测定法

2.1.1 色谱条件 Waters Symmetry C18柱(150×3.9 mm，5 μm),流动相：乙腈∶水=35∶65(V/V)，流速1.0 mL/min检测波长254 nm，柱温：25℃，进样量10 μL.

2.1.2 标准溶液的制备 精密称取喜树碱标准品10.0 mg于100 mL容量瓶，以甲醇(色谱纯)为溶剂超声溶解并定容至刻度，摇匀备用.临用时取5 mL备用液于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度,摇匀即可.

2.1.3 线性关系 精密吸取标准溶液0.1、0.4、0.8、1.5、3、6 mL置于10 mL的容量瓶中，分别用纯甲醇定容至刻度，摇匀.在以上色谱条件下进行分析，每个样品连续进样5次，记录图谱及色谱参数，分别以喜树碱浓度(y,单位：μg/mL)和峰面积(x)进行线性回归方程为：y=6.05x×10-5-2.547,R=0.999 7,线性范围：4.04～43.96 μg/mL.

2.1.4 精密度实验 取同一标准品溶液，在色谱条件下连续进样5次，喜树碱的平均峰面积为138 940，标准差为8 424，RSD=1.15%(n=5).

2.1.5 稳定性实验 取同一样品溶液，在色谱条件下进样，每隔2 h测一次，连续测定7次，在12 h内喜树碱的平均峰面积为1 588 034.6，标准差为152 126.3，RSD=4.77%，说明样品溶液在12 h内是稳定.

2.1.6 重复性试验 取同一样品5份，精密称定，按2.1.3方法提取，将样品溶液注入液相色谱仪，喜树碱的平均峰面积为2 589 336，标准差为8 855.36，RSD=3.01%，表明重复性符合要求.

表1 各方法喜树碱提取率 ‰

2.2 提取率的计算

喜树碱提取率与样品浓度(μg/mL)、样品体积(mL)及样品质量(g)的关系按以下公式计算：提取率‰=浓度×体积/样品质量×103×10-6.

2.3 样品溶液的提取方法选择

精确称取喜树嫩叶粉末，分别用甲醇提取法与碱法，重复3次，用HPLC测定提取液中喜树碱含量.以喜树碱的提取率为考察指标进行比较，结果见表1.

2.3.1 甲醇提取法 精密称取喜树嫩叶粉末(过60目筛)1 g 4份于4个100 mL容量瓶，分别加入80 mL 60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、无水甲醇(分析纯)，于50℃下超声提取1 h，冷至室温，加各种浓度的甲醇稀释至刻度，摇匀，用针头式过滤膜过滤提取液，取过滤液10 μL进样.

2.3.2 碱法 精密称取喜树嫩叶粉末(过60目筛)1 g 3份于3个100 mL锥形瓶中，分别加入0.05、0.1、0.2 mol/L的NaOH溶液20 mL,浸泡30 min后，常温下超声提取1 h，离心，倾出提取液.再加入相同体积的NaOH溶液在相同条件下提取1 h，共提取3次，合并提取液.滴加盐酸调节至pH值为4～5，离心定容.

2.4 干燥方法

取喜树嫩叶于80℃的恒温干燥箱中干燥至恒重即可.

2.5 流动相的选择

实验以乙腈—水体系为流动相，体积比在25∶75～60∶40之间时喜树碱的保留时间为3.9～8.59 min，最终选择乙腈—水(35∶65)为流动相，喜树碱的分离度良好，且喜树碱峰的理论塔板数高于4000，在此条件下，做出的喜树碱标样和喜树嫩叶的图谱如图1、2所示.

图1 喜树碱对照品 图2 喜树嫩叶样品

2.6 样品结果分析

结果表明：喜树碱提取率纯甲醇>80%甲醇>70%甲醇>60%甲醇>0.2 mol/L NaOH>0.1 mol/L NaOH>0.05 mol/L NaOH.

从实验结果可以看出，甲醇提取法明显优于碱提法，甲醇的浓度对喜树碱的提取率有极显著影响.但是纯甲醇的提取率与80%甲醇的提取率没有明显的变化，而且从经济利益出发，筛选出从喜树嫩叶中提取喜树碱的最佳工艺条件：称取样品1 g于100 mL容量瓶中，加80%甲醇溶液90 mL，50℃超声提取1 h,冷却至室温，离心取样，进行分析.

[1] 中国科学院中国植物编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1983.

[2] Wall M E,Wani M C,Cook C E,et al.Plant antitumor agents.The isolation and structure of camptothecin, a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor from Camptotheca acuminate[J].J AmChem Soc,1966,88(16):388-389.

[3] Hsiang Y H,Herizbeng R,Hecht S,et al.Camptothecin induces protein-iinked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I[J].J Biol Chem,1985,260(27):14873-14878.

[4] Hsiang Y H,liu L F.Wall M E,et al.DNA topoisomerase I-mediated DNa cleavage and cytotoxicity of camptothecin analogues[J].CANCER Res,1989,49(16):4385-4389.

[5] 阎秀峰，王洋，于涛，等.喜树叶中喜树碱含量的高效液相色谱分析[J].分析测试学报，2002,21(2):15-18.

[6] Liu Z J,Carpenter S B,Bourgedis W J,et al.Vatiations in the secondary metabolite.camptothecin in relation to tissue age and season in camptotheca acuminata[J].Tree physiol,1988,18(4):265-270.

[7] Meyer M L,Nessler C L,Mcknight T D.Sites of accumulation of the antitumor alkaloid camptothecin in camptotheca acaminata[J].Planta Med,1994,60(6):558-560.

[8] 张丽艳，杨玉琴.反相高效液相色谱法测定喜树果实中喜树碱的含量[J].中国中药杂志，1997，22(4)：234-235.