羧甲基-β-环糊精用于5种苯乙胺类药物的毛细管电泳拆分

周 婕， 李颖慧， 邵 红， 张振中

(1.郑州大学 药学院 河南 郑州 450001；2.河南省分子医学重点实验室 河南 郑州 450052)

0 引言

苯乙胺类肾上腺素能激动剂是目前最为常用的平喘药.该类药物具有苯乙胺的基本结构，大多具有一个或两个手性中心，存在对映异构体，其结构式见图1.对于含有一个手性中心的苯乙胺类药物，药理学活性通常在R对映体[1].如克仑特罗有效的为R对映体，而S对映体对疗效没有贡献[2]；沙丁胺醇R对映体药效比S对映体强80倍[3]，且在体内的吸收率比S对映体高[4]；班布特罗R对映体对丁酰胆碱酯酶的抑制速度是S对映体的5倍[5].丙卡特罗含有两个手性中心，即4个对映体，但是作为药品的外消旋丙卡特罗中仅有2个对映体，即(R，S)型和(S，R)型.对它们进行对映体分离对于进一步研究其药理和开发副作用更小的新药有重要的意义.

对上述药物的拆分有高效液相色谱法(HPLC)[6]和毛细管电泳法(CE)[7-9].毛细管电泳具有手性选择剂消耗少，运行成本低和分离效率高等优点.β-环糊精及其衍生物是目前最为常用的手性选择剂.对班布特罗、妥洛特罗和丙卡特罗，目前尚未见采用羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD)为手性选择剂采用毛细管电泳对其拆分的文献报道.本文以CM-β-CD为手性选择剂，对上述5种药物进行手性拆分，并对影响拆分的因素，如手性选择剂的种类、浓度，缓冲溶液的pH值，分离电压和柱温进行考察，以确定最佳拆分条件.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪(二极管阵列检测器及32Karat软件系统)，熔融石英毛细管柱(48.5 cm×75 μm，有效长度40 cm)(河北永年光导纤维厂)，Millipore 超纯水器(美国)，雷磁pHS-3C精密pH计(上海精密科学仪器有限公司)，BP211D 1/10万天平(德国Sartorius公司).

β-环糊精(β-CD),羧甲基-β-环糊精(CM-β-CD),三甲基-β-环糊精(TM-β-CD),羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)(Fluck公司)，二甲基-β-环糊精(DM-β-CD)(比利时Acros公司)，盐酸克仑特罗对照品(中国药品生物制品检定所)，盐酸班布特罗对照品(湖南九典制药有限公司)，盐酸丙卡特罗对照品(河南京豫药业有限公司)，硫酸沙丁胺醇对照品(山东省莒南制药厂)，盐酸妥洛特罗对照品(天源精细化学品厂)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯.

图1 5种药物的结构

1.2 试剂配制

1.2.1样品溶液配制

精密称取对照品2.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，即得200 mg·L-1的样品溶液.

1.2.2缓冲溶液的配制

首先配制50 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液，加入一定量CM-β-CD，得含有一定浓度CM-β-CD的50 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液.然后，用1 mol·L-1磷酸和0.1 mol·L-1NaOH溶液调节pH值，即得具有一定pH值一定浓度CM-β-CD的50 mmol·L-1的磷酸盐缓冲液.

1.3 实验条件

电压进样方式为10 kV×5 s；工作电压为20 kV；柱温为15 ℃；检测波长200 nm；运行缓冲液：含10 mmol·L-1CM-β-CD的50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液 (pH为3.5).使用前用0.1 mol·L-1氢氧化钠冲洗30 min，超纯水和缓冲液分别冲洗10 min；每次运行前用0.1 mol·L-1氢氧化钠、超纯水和缓冲液分别冲洗3 min.

2 结果与讨论

2.1 手性选择剂的影响

分别以β-CD、CM-β-CD、DM-β-CD、TM-β-CD 和HP-β-CD作为手性选择剂，在同一条件下，研究它们对上述5种药物手性分离的影响.以含10 mmol·L-1环糊精的50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液 (pH为3.5)为背景电解质，分离电压为20 kV，柱温为15 ℃.结果发现，β-CD对克仑特罗、妥洛特罗和丙卡特罗存在手性选择性，其中，克仑特罗和丙卡特罗在此条件下达到了基线分离，TM-β-CD仅对妥洛特罗存在手性选择性.DM-β-CD、HP-β-CD和CM-β-CD对5种药物都存在手性选择性.在此条件下，DM-β-CD使克仑特罗和丙卡特罗达到基线分离，HP-β-CD使丙卡特罗达到基线分离.采用CM-β-CD时，5种药物均达到了基线分离，且分离度较大，其中丙卡特罗的分离度达到了25.37.因此，本文选择CM-β-CD为手性选择剂.

2.2 缓冲液pH值的影响

本文所研究的5种药物为碱性化合物，可以质子化为阳离子，其电泳方向与电渗流同向.采用pH值较低的酸性缓冲液做背景电解质，可以抑制电渗流和减小毛细管壁的吸附，使分离度得到提高.因此，本文选择pH为2.5～6.5，以考察pH值对5种药物对映体分离的影响.

CM-β-CD是一种阴离子修饰的环糊精，在缓冲液中因电离而变为带有负电荷的阴离子，其电泳方向与手性分子相反.pH值在2.5～6.5范围内，被分离样品的质子化程度随pH值的升高而逐渐减小，CM-β-CD的电离度迅速增加，两者之间相互作用的几率显著增加.由于电渗流随着pH值的升高而增大，使被分离样品与CM-β-CD在毛细管柱的迁移时间缩短，较高的pH值反而不利于对映体的分离，实验发现在pH值为3.5时，手性分离效果最好，5种药物均达到了基线分离(见图2).

图2 5种药物的拆分电泳图

2.3 手性选择剂浓度的影响

为了研究CM-β-CD浓度对拆分的影响，分别考察了浓度为1,5,10和15 mmol·L-1时的情况(图3).当CM-β-CD浓度从5 mmol·L-1升高到10 mmol·L-1时，5种药物的分离度都有明显的改善，且迁移时间适中.当CM-β-CD浓度从10 mmol·L-1升高到15 mmol·L-1时，仅班布特罗的分离度有明显改善，其他药物的分离度虽有改善，但并不明显，且由于CM-β-CD浓度增大，引起迁移时间延长，不利于分析.因此，选择10 mmol·L-1为拆分剂浓度.

图3 CM-β-CD浓度对分离的影响

2.4 分离电压的影响

以含10 mmol·L-1CM-β-CD的50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液 (pH为3.5)为背景电解质，考察分离电压为15～25 kV.对班布特罗，20 kV时分离度较好，且迁移时间适中.25 kV时电流较大，由此引起的焦耳热增加，影响分离效果，对其他药物也有类似的现象.因此，选择20 kV为分离电压.

2.5 柱温的影响

以含10 mmol·L-1CM-β-CD的50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液 (pH为3.5)为背景电解质，考察柱温分别为15，20,25 ℃对分离的影响.随柱温的升高，各对映体的迁移时间逐渐减小，这是因为温度升高使得缓冲溶液的黏度降低，对映体的表观电泳迁移率增大所致.随着温度的降低，分离度增大.说明手性药物与CM-β-CD形成包结络合物的过程是一个放热过程，降低温度有利于包结络合物的形成，进而有利于对映体的分离.因此，选择柱温为15 ℃.

2.6 手性拆分机理的探索

环糊精及其衍生物分离对映构体的机理研究尚未成熟,目前关于拆分机理的解释主要有：包含机理(或缔合机理)，即对映体分子和CD 及衍生物形成程度不同的包络物,而使它们分离；诱导作用机理，当手性分子靠近CD 时,对手性区域的基团产生诱导作用,具有合适构象的手性分子[10]的这种作用较强，根据作用强度的不同而使对映体分离；主客体相互作用机理，即CD 与手性分子之间存在氢键,偶极-偶极相互作用以及范德华力等,这些作用力对对映体的拆分均有影响[11-12].

环糊精是环形低聚糖分子,具有外亲水、内疏水性质， 溶液中对映体分子可以根据CD 分子空间手性环境,选择性地进入CD分子空穴,形成一种包合络合物,然后通过电泳迁移速度差异的增加达到拆分目的[11-12].根据拆分结果及苯乙胺类药物的结构,该拆分机理可能是包含机理和主客体相互作用机理相结合,即被拆分化合物的疏水部分苯环进入CM-β-CD 内,手性碳上的—OH 与CM-β-CD空穴外的—COOH 形成氢键,而—N也与—OH 形成氢键.但是由于手性药物手性中心在空间的取向不同，而CM-β-CD形成配合物的稳定常数不同,旋光活性物质的表观迁移速度产生差别而分离.

3 结论

通过比较各种手性选择剂的拆分效果，选择CM-β-CD为手性选择剂，并确立了最佳拆分条件：以含10 mmol·L-1CM-β-CD的50 mmol·L-1磷酸盐缓冲液 (pH为3.5)为背景电解质，分离电压为20 kV，柱温为15 ℃，并且对苯乙胺类药物的手性拆分机理进行了初步探讨.

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