聚乙烯醇－海藻酸钠固定Flavobacterium sp.对地表水的修复效果

李海波，李英华，王 洪，王 鑫，邹 轶，孙铁珩

（沈阳大学 区域污染环境生态修复教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110044）

聚乙烯醇－海藻酸钠固定Flavobacteriumsp.对地表水的修复效果

李海波，李英华，王 洪，王 鑫，邹 轶，孙铁珩

（沈阳大学 区域污染环境生态修复教育部重点实验室，辽宁 沈阳 110044）

从河流底泥、河水水体中分离得到一株黄杆菌Flavobacteriumsp.（Oil 56）.用聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）和海藻酸钠（sodium alginates，Na·Alg）为包埋载体，以五硼酸铵和氯酸铁溶液为交联剂，固定黄杆菌Flavobacteriumsp.Oil 56得到固定化球形颗粒.对比研究了固定化颗粒与游离菌对地表水的降解效果，结果表明在COD初始质量浓度为77～205 mg／L时，用固定化Flavobacteriumsp.Oil 56修复48 h的COD去除率为48.2%～50.6%，比游离菌的降解效率提高了42.7%～45.8%.利用扫描电镜（SEM）研究了固定化球形颗粒在降解过程中的微环境变化.

固定化微生物；地表水；黄杆菌；微环境

地表水质的快速不可逆性恶化源于工农业的高速发展.而受污染地表水的特殊性质增加了传统修复技术实施的难度，探索新型高效的修复技术迫在眉睫［1］.

微生物固定化技术的核心是：在可调控环境条件下，通过生物降解和生物转化，可原位消减污染，费用低廉、简单高效、不产生内源污染.鉴于生物水处理科学内涵的一致性，将固定化微生物技术引入地表水修复领域在理论上是可行的，实践上也先后出现了一些成功的工程事例［2－3］.微生物固定化技术作为新兴的污水生物处理方法，已经在生活污水和行业废水治理中得到较为成熟的应用，但用于修复污染地表水体则鲜见文献报道［4－5］.因此，本研究以 COD 为主要污染指标，采用聚乙烯醇 －海藻酸钠包埋方法固定Flavobacteriumsp.技术，形成Flavobacteriumsp.固定化球形颗粒，对比了固定化颗粒与游离菌对地表水中COD的降解效果.同时，采用SEM技术，获得固定化颗粒的微观结构解析，初步阐明固定化微环境屏蔽机理.

1 材料与方法

1.1 地表水水质

受污染地表水采自沈阳市青年公园湖.采用国标方法［6］，分析了样品中的p H、COD、SS、NH3－N、TP和DO，结果如表1所示.

表1 地表水主要水质指标Table 1 Main qualityindexes of the surface water

主要污染指标COD的值远远超过地表水环境质量标准（GB 3838—2002）Ⅴ类标准，DO指标低于Ⅳ类标准.

1.2 供试菌株

实验用菌株分离筛选自沈阳城市运河河水、运河底泥以及EM（北京）菌液，部分为中科院沈阳应用生态研究所污染生态组保存菌种.经筛选驯化实验，获得一株对COD具有高效降解去除能力的细菌，其实验室命名分别为：Oil 56.而后用平板划线分离法进行纯化.纯化得到的菌株（包括实验室保存菌株）再通过解酯酶实验进行筛选，目的在于筛选出对脂肪烃类等城市地表水中含量较高的污染物存在较强降解能力的菌株.由于地表水COD值较低，属于微C营养水体，所以在对菌株进行了COD降解能力测试后，对菌株进行了低C营养驯化实验（图1）.

图1 Oil 56低C营养驯化结果Fig.1 Results of Oil 56 domestication under low C nutrition

低C营养驯化实验结果表明，筛选出的菌经过驯化实验，能够在低C营养条件下，良好生存生长，适应地表水微C营养特性.

在蛋白胨基础固体培养基上呈黄色，镜下观察发现细胞呈细长杆状，周生鞭毛，不形成芽孢，革兰氏染色呈阴性.其细菌形态如图2所示，生长曲线如图3所示.

图2 Oil 56显微照片Fig.2 Micrograph for Oil 56

经菌株初步鉴定结果，Oil 56为黄杆菌属Flavobacteriumsp.Oil 56.

1.3 分析方法

采用重铬酸钾法测定水体COD值.需要指出的是：由于COD值较小时，该方法的灵敏度受到限制，因此每次修复试验后期的测试值，仅可以反映出COD变化规律，不足以成为真实的修复终点值.

图3 Oil 56生长曲线Fig.3 Growth curve for Oil 56

采用扫描电子显微镜分析固定化产品的微观结构和对比固定化细菌与游离菌形态差异.一般进行细菌SEM制样时均采用戊二醛固定（蛋白凝结）的方法.本研究发现，对于Oil 56细菌，戊二醛浓度过高将造成细菌溶解.因此，本研究实验了透射电镜制样固定剂锇酸＋戊二醛的联合固定技术，采用5份体积的低浓度戊二醛预先固定，然后采用1份体积的锇酸二次固定，两次操作时间间隔1.5 h.采用CO2临界点干燥技术对样品进行干燥，等离子高速喷金.分别切制颗粒不同位置制片，观察.采用平板计数方法测定细菌数量.

2 结果与讨论

2.1 固定化微生物与游离菌的修复效果对比

地表水COD初始质量浓度为77～205 mg／L条件下，对比研究Flavobacteriumsp.Oil 56固定化球形颗粒与游离菌的修复效果随修复时间的变化趋势，结果如图4所示.

图4 不同初始质量浓度下固定化及游离菌对COD的降解效果Fig.4 Degradation effects of COD under different initial concentrations for immobilized and free cells

城市静止或缓流污染水体自我稀释净化能力差，污染源多，影响范围广，对其修复最好在短时间内获得效果，才能够最大限度地避免污染水体对城市环境（旅游、休闲，城市地下水）的破坏［7］.利用固定化细菌修复城市静止或缓流污染地表水，尤其是景观水体，具有较好的应用前景［8］.实验室模拟修复实验结果表明：固定化Flavobacteriumsp.球形颗粒产品对不同初始COD质量浓度的地表水体均能发挥较好的修复效果，与游离菌相比，在COD初始浓度为77～205 mg／L时，固定化Flavobacterium sp.Oil 56修复48 h的COD去除率为48.2%～50.6%，比游离菌的降解效率提高了42.7%～45.8%.尤其对于COD质量浓度较低的水体，固定化菌剂表现出良好的微C营养适应性，经72 h修复，水体残留COD质量浓度最低可达10 mg／L以下.与污水生化处理技术相比，72 h仍是一个较长的时间，对于流动水体，如何保证充足的水力停留时间，将是一个急需解决的课题.

为了获得最适宜进行细菌固定化修复的初始COD质量浓度，对固定化颗粒修复72 h的水体残留COD进行了比对，结果表明：初始COD质量浓度高水样COD残留值也高，这意味着如果规定同一修复终点，则后者需要更长的运行周期.初始COD质量浓度为77 mg／L和110 mg／L时，修复72 h达到的效果相似，后者水样残留COD略高，但和前者很接近.这说明本研究筛选得到的细菌更适宜低C营养地表水体修复，但对高C营养地表水体，也可以发挥较好效果，即对于以COD为主要污染指标的轻污染和重污染地表水体，都可发挥高效修复作用.

2.2 固定化微生物微观结构

细菌在固定化颗粒内部的生存空间是相对封闭和稳定的微环境，这种特定的微环境既可以保证细菌正常的生理代谢过程，又可以保护细菌不受外界不利因素的侵害，如抵御土著细菌的竞争，防止噬菌体和毒性物质的吞噬和毒害，等等［9－10］.因此，良好的微环境有助于强化细菌对地表水中有机污染物的高效利用或降解，进而强化修复过程［11］.但不论固定化技术如何进步，被束缚的空间和自由的空间相比，传质渗透性总会发生改变，而这些改变几乎都向着不利于细菌生长的方向发展；同时，固定化过程也是生物体的受害过程，化学反应放热和物理冷冻的活性抑制，都可以导致细菌生理活性发生重大改变，甚至导致固定化失败［12－13］.因此，在研究微环境机制的同时，有必要了解细菌形态的变化，因为细菌形态的变化有时候是微环境作用的结果，这两个方面很难截然分开.对比研究了固定化前后细菌形态的变化情况，结果如图5所示.

图5 固定化及游离菌的SEM照片Fig.5 SEM photos for immobilized and free cells

图5a是固定化前Oil 56的自由状态.在固定化颗粒中心区位置附近（图5b），Oil 56形态发生了明显改变：固定化态的Oil 56菌体大小不一，表面有较多的沉积物（deposit），凹凸不平，存在大量呈萎缩状态的短杆，甚至存在发生异常断裂的类杆状菌体，有些形状极不规则，大量菌体集中在一起形成不规则菌落，菌落周围空间狭窄；从照片左下角可见菌体被载体材料包埋情况.尽管PVA载体网络孔隙发达，但过于紧密的网络结构限制了细菌自由生长，导致菌体形态发生明显改变；菌体长短不一的现象说明：没有受到载体网络束缚的细菌可以分裂繁殖，受到束缚的菌体则失去了自由繁殖的足够空间；此外，耗氧培养过程中，颗粒外层更容易获得足够的氧气，而越靠近颗粒中心，细菌获得氧气的概率就越小，营养底物向内传质的能力被抑制，代谢产物向外扩散传质能力也受到限制，这也是菌体变形的诱因之一.在剖面1（图5c）位置出现较大空洞，这是因为Na·Alg产生了溶解现象而造成的.Oil 56在大的“溶洞”里可以自由生长，菌体大小基本一致，但表面仍包裹有较多的沉积物质，一些菌体局部产生凹陷和膨胀现象，这是因为固定化颗粒内部结构不均匀，考虑到传质过程的连续性和传质阻力的串联性，与该位置相联系的其他部位传质性差，将导致整个传质过程在路线上丧失连贯，代谢产物不能迅速扩散到颗粒外，造成在菌体表面沉积积累，在一定程度上限制了菌体的自由生长，也会诱发菌体形态改变.细菌在大溶洞中优先生长，随着细菌浓度增加，进一步压迫溶洞壁，对周围的微小孔隙将产生额外压力，导致这些孔隙缩小甚至成为盲孔，细菌的不均匀生长将最终导致局部受力不均匀，颗粒破碎.

越靠近固定化颗粒表面，传质扩散性能越优，细菌获得氧气、底物的机会就越大，排泄和释放产物的空间越不受限制（图5d）.Oil 56在固定化颗粒表层生长良好，菌体分散均匀，个体形态一致，处于裂殖期；颗粒孔隙发达，孔隙内壁光滑，对菌体的限制作用以孔隙包埋为主，即，菌体在孔隙内的吸附，几乎未见载体包埋现象.因此，细菌生长不受载体包埋束缚的限制.但Oil 56表面仍存在一定量的沉积物，沉积物对菌体的包裹使得细菌无法像在液体培养时那样自由生长，菌体的形态依然发生了同中心区以及中间区类似的改变.这表明：固定化造成的传质扩散能力下降是一个不能完全消除的矛盾.

3 结 论

（1）对城市地表水污染特点，从河流底泥、河水水体以及EM菌液中分离得到一株对COD具有较高去除能力的细菌：Flavobacteriumsp.Oil 56.

（2）用聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）和海藻酸钠（sodium alginates，Na·Alg）为包埋载体，以五硼酸铵和氯酸铁溶液为交联剂，固定Flavobacteriumsp.Oil 56得到球形颗粒.

（3）固定化Flavobacteriumsp.Oil 56对不同COD初始质量浓度的地表水均具有较好的修复效果.COD初始质量浓度为77.4 mg／L的城市地表水，经72 h修复，水体残留COD值最低可达到10 mg／L以下.COD初始浓度为77～205 g／L时，用固定化Flavobacterium sp.Oil 56修复48h的COD去除率为48.2%～50.6%，比游离菌的降解效率提高了42.7%～45.8%.

（4）利用SEM分析了固定化球形颗粒的微观结构和细菌在颗粒内部的形态变化，结果表明虽然颗粒内部丰富的孔隙网络结构为细菌提供了良好的生存空间，但PVA－Na⋅Alg包埋体系尚存在一些需要改进的结构缺陷.

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Treatment efficiency of polyvinyl alcohol and sodium alginate immobilizedFlavobacteriumsp.

LIHaibo，LIYinghua，WANGHong，WANGXin，ZOUYi，SUNTieheng
（Key Laboratory of Regional Environment and Eco－Remediation （Ministry of Education），Shenyang University，Shenyang 110044，China）

One strain was isolated from hydrocarbon－polluted surface water and sludge and was representative ofFlavobacteriumsp.（strain Oil－56）.Polyvinyl alcohol（PVA）and sodium alginates（Na·Alg）embedding technology were adopted forFlavobacteriumsp.immobilization.Secondly，the study investigated the treatment efficiency of the immobilizedFlavobacteriumsp.The immobilizedFlavobacteriumsp.beads made in this study were suitable for remediation of COD－contaminated surface water with a wide range of initial COD values.At initial COD 77～205 mg／L，the residual COD values for immobilized cells were 38～98 mg／L after 48 h，with removal efficiencies of 48.2%～50.6%，which was 42.7%～45.8%higher than the free cells.The Scanning Electronic Microscope（SEM）analysis indicated that the bead microstructure was suitable for growth of Flavobacterium sp.

immobilized cell；surface water；Flavobacteriumsp.；micro－environment

X 703.1

A

1008－9225（2012）02－0001－05

2011－11－30

国家自然科学基金资助项目（50908151，51108275）；辽宁省自然科学基金资助项目（20082195）；辽宁省高校优秀人才支持计划资助项目（LR201028）.

李海波（1974－），男，河北承德人，沈阳大学教授，博士；孙铁珩（1938－），男，辽宁海城人，沈阳大学教授，博士生导师，中国工程院院士.

王 颖】