早食李离体胚培养体系的建立

谢志亮，吴振旺，彭 兵，何业华

（1.温州科技职业学院，浙江 温州 325006；2.华南农业大学 园艺生物技术研究所，广东 广州 510640）

早食李离体胚培养体系的建立

谢志亮1.2，吴振旺1，彭 兵2，何业华2

（1.温州科技职业学院，浙江 温州 325006；2.华南农业大学 园艺生物技术研究所，广东 广州 510640）

以早食李胚为研究材料，分析了基本培养基、6-BA、ІBA、种皮以及AgNO3、GA3、СH、AС等几种添加物对李胚离体培养的影响，初步建立了早食李胚离体培养体系。李胚萌发成苗培养基为F14+6-BA 0.5mg/L+ІBA 0.3mg/L+琼脂7g/L+3%蔗糖，并可作为壮苗培养基；丛生芽增殖培养基为F14+6-BA 1-2mg/L+ІBA 0.3mg/L+琼脂7g/L+3%蔗糖；生根培养基为1/2MS+ІBA 3mg/L+琼脂7g/L+3%蔗糖。其中，早食李胚种皮的剥除与否是其萌发的关键。单独添加AgNO3、GA3、СH、AС等4种附加物对早食李的萌发成苗率没有作用，而同时添加却能提高其成苗率。

早食李；胚培养；不定芽诱导；增殖

三华李是中国李P. salicina系统中的一个特殊栽培群体，其需冷量低、品质较好，为我国南亚热带地区栽培最广和面积最大的李优良品种群[1]。三华李自花不结实或少量结实，自然杂交种子田间播种难萌发，即使是经低温、湿沙等处理后再在WPM培养基上播种也很难萌发。目前三华李（品种群）主要采用常规的嫁接方法进行繁殖，效率低下。利用成熟胚离体培养技术可大大提高胚的萌发成苗率，且不受季节等限制，能在短时间内产生大量的具有优良遗传性状的苗木，满足市场的各种需求，也可进一步为组织培养、细胞培养及遗传转化提供原始材料。因此，建立稳定的三华李胚培养体系，利用生物技术手段将一些抗性、高产等目的基因导入三华李品种中，是促进三华李品种改良进程和三华李产业发展的一种有效手段。

本研究以三华李品种群中的早熟品种-早食李的成熟种子为材料，分析早食李成熟胚萌发的影响因子，建立早食李胚离体培养体系，以对三华李的工厂化组培育苗、品种改良以及种质资源的保存等的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

于2008年5月在华农大园艺学院果园采取青中带黄的早食李果实作为试验材料。

1.2 方 法

1.2.1 消毒

将采集的果实用刀削掉外层果肉，用铁锤沿缝合线敲开内果皮，置于无菌接种瓶内，放入接种台里，用75%酒精消毒1 min，再用0.1%的升汞消毒8～10 min，最后用无菌水洗5次，取出置于无菌纸上，用灭菌过的镊子小心将种皮剥掉，接种于培养基中。如种皮仍难剥除，则将其置于无菌水中放置1～2d，待种皮软化后再剥除种皮接种。

1.2.2 基本培养基的筛选

以MS、1/2 MS、1/4 MS、1/8 MS、WPM、F14（分别为处理1、2、3、4、5、6）为基本培养基，接种后先在全黑暗条件下培养7 d，然后再转到正常光条件下培养。

1.2.3 不同BA浓度对成熟胚培养的影响

以F14+7 g/L琼脂+3%蔗糖+0.3 mg/L ІBA为培养基，附加不同浓度的6-BA，6-BA浓度设置为0.5，1.0，2..0，4.0，8.0 mg/L（分别为处理1、2、3、4、5），以不添加6-BA作对照，接种后先在全黑暗条件下培养7 d后再转到正常光条件下培养。

1.2.4 添加附加物对种子萌发的影响

将剥除种皮的种子接种到分别添加不同附加物的F14培养基上，附加物分别为AgNO35.0 mg/L、GA35.0 mg/L、СH 500 mg/L、1%AС以及AgNO3500 mg/L+GA3500 mg/L +СH 500 mg/L+1%AС（分别为处理1、2、3、4、5），以不添加任何物质作为对照。

1.2.5 生根培养

将高2 cm以上的粗壮苗接种在含不同ІBA浓度的1/2MS培养基上。ІBA浓度设置为0.1、0.3、0.9、3.0、9.0 mg/L 的5个浓度梯度（分别为处理1、2、3、4、5）。接种30 d天后进行生根率的统计。

1.2.6 培养条件与统计方法

培养室温度为25±2℃，相对湿度保持在60%～80%，光强为1 500～3 000 LX，光照时间为14 h/d。正常光条件下培养指在培养室条件下培养。

接种30 d后对材料的萌动率、成苗率等情况进行观测和统计。

2 结果与分析

2.1 不同基本培养基对胚萌发的影响

不同基本培养基成分、比例不同，对早食李胚的萌发率与成苗率影响也不一样（表1）。在所供试的6种培养基中，早食李的萌动率以F14最高，为95.5%；以WPM最差，为75.0%。成苗率也以F14最高，为27.3%，其次为1/4 MS（26.7%），两者间差异不显著，最低为MS，仅13.3%。综合考虑，早实李成熟胚培养以F14培养基最为适宜。

表1 不同培养基对早食李胚萌发的影响†Table 1 Effects of different culture medium on germination of “zaoshi” plum

2.2 不同BA浓度对胚萌发的影响

一定浓度的6-BA有利于早食李胚芽萌发，以0.5 mg/L 6- BA时效果最好，萌动率和成苗率分别为94.5%和77.3%，苗木长势较好、生长粗壮。但6-BA浓度超过0.5 mg/L 时，不定芽诱导率提高，以6-BA浓度1～2 mg/L最高，不定芽诱导率可达85%以上，但不定芽较矮小，胚根逐渐褐变并死亡，且萌动率和成苗率有所下降。当6-BA浓度达到4 mg/L时，萌动率和成苗率比对照显著下降。而当6-BA浓度达到8 mg/L时，成苗率为零。如表2所示。

故早食李胚的萌发成苗以 6-BA浓度0.5 mg/L为宜，并可作为壮苗培养基用。增殖培养时可采用6-BA浓度1-2mg/L。如图1所示。

表2 BA浓度对早食李胚萌发的影响Table 2 Effects of different concentrations of BA on germination of “zaoshi” plum

图1 早食李不定芽的诱导Fig. 1 Adventitious bud induction of “zaoshi” plum

2.3 不同添加物对胚萌发的影响

以F14为基本培养基，添加AgNO3、GA3、СH、AС等附加物不能提高早食李种胚的萌发成苗率，反而有所降低。但几种附加物组合到一起添加时，虽降低了早食李的萌动率，但成苗率却显著提高。如表3所示。

表3 培养基中不同添加物对早食李胚萌发的影响Table 3 Effects of culture medium of different additives on germination of “zaoshi” plum

2.4 ІBA浓度对不定根发生的影响

将高于2 cm的粗壮小苗接种在含有ІBA的生根培养基上，8天后开始有不定根的发生，刚开始时从切口处皮层开裂，乳白色的不定根逐渐发生，呈辐射状延伸，随后须根逐渐发生，并随浓度的升高，不定根的数量增多，变粗壮。但不含ІBA的培养基不发生根。从表4可知，在一定浓度范围内，随ІBA浓度的升高，不定根诱导率也升高，以3.0 mg/L时达到最高，为84.6%，与其他浓度相比达到显著水平；超过此浓度，不定根的发生率反而下降。故促进早食李生根的ІBA浓度以3.0 mg/L为宜。如图2所示

表4 ІBA浓度与不定根的发生Table 4 Relations of concentration of IBA and adventitious root rate of “zaoshi” plum

图2 早食李不定根的诱导Fig. 2 Adventitious root induction of “zaoshi” plum

2.5 炼苗及移栽

将已生根的粗壮苗移到室外锻炼20 d左右，再逐步打开瓶盖，2～4 d后再移栽。移栽前用清水洗除培养基，20%百菌清杀菌2～3 min，栽入草炭︰珍珠岩为1︰1的基质中，浇透水，保持小苗周围空气相对湿度在85 %以上，温度20～30 ℃，遮荫网覆盖。在此条件下，试管苗成活率可达70 %以上。

3 结论与讨论

造成种子的休眠主要是由于种皮的不透水性、不透气性、机械阻碍及种皮内含有的抑制物质[3]，种皮的不透性也将阻止种皮抑制物的渗出而阻碍种子萌发，一般胚的萌发需经低温处理或加进一些生长调节物质才能打破种子的休眠[2]。种皮是抑制三华李胚萌发的关键因子。在实际生产育苗中，三华李种子其萌发率几乎为零。在实验室中，未剥除种皮的三华李种子（华蜜大蜜李和白脆鸡麻李）在培养基上不萌发，种皮去除后则能达到65.9%的萌动率，即使是去皮直接种植于营养土中也能萌芽。

此外，不同植物对营养成分的需求也不同，不同培养基所含有的营养物质组成有差别，选择合适的培养基对于组织培养的成败至关重要。早食李成熟胚胚培养以低盐的培养基为好，这与陈颖等的研究结果相似[4]。但几种低盐培养基中，以F14培养基为最佳，这可能与其中的比值不同有关。

早食李属于三华李品种群中的早熟品种，五月初果实成熟时采集其胚可能尚未发育完全或需要一段时间的后熟才能发育完全。因此，在培养过程中加入一定量的外源生长调节物质（6-BA）有利于早食李胚的萌发成苗及不定芽的分化，但苗长势、高度等不同，应根据目的选择合适的6-BA浓度。添加AgNO3、GA3、СH、AС等附加物不能提高早食李胚的萌发成苗率，反而有所降低，但几种附加物同时添加却又提高成苗率，可能与所试用的浓度、品种等有关，具体有待分析。

通过本试验研究表明，李胚萌发成苗以F14+6-BA 0.5 mg/L+ІBA 0.3 mg/L琼脂7 g/L+3%蔗糖最为适宜，并可作为壮苗培养基；增殖培养基为F14+6-BA 1～2 mg/L+ІBA 0.3 mg/L+琼脂7 g/L+3%蔗糖；生根培养基为1/2MS+ІBA 3 mg/L+琼脂7 g/L+3%蔗糖。在离体培养中，早食李胚种皮的剥除与否是其萌发的关键。单独添加AgNO3、GA3、СH、AС等4种附加物对早食李胚萌发率和成苗率没有作用，而同时添加时却能提高成苗率。

[1] 何业华，韩景忠，谢志亮，等. 两个三华李新品种的选育[С]// 张加延主编:李杏资源研究与利用进展（五）．北京：中国林业出版，2008：174-176.

[2] 李会芳，许 正，杨 英，等. 影响野生樱桃李种子萌发相关因素研究初报[J]. 新疆农业科学，2007，44（1）：27-30.

[3] 王利宝，董丽芬. 油松种胚休眠特性及解除胚休眠的方法[J].中南林学院学报，2006，26（3）：19-23.

[4] 陈 颖，曹福亮，谢寅峰, 等. 5个银杏优良品种成熟胚离体繁殖培养基的选择研究[J].西北植物学报，2004, 24( 11) :2025-2032.

Establishment of in vitro embryo culture system in Prunus salicina cv. zaoshi

XІE zhi-liang1,2,WU Zhen-wang1,PENG Bing2,HE Ye-hua2
(1.Wenzhou Vocational Сollege of Science & Technology ,Wenzhou 325006 ,Zhejiang ,Сhina ;2.Іnstitute of Biotechnology for Horticuhural Сrops ,South Сhina Agricultural University ,Guangzhou 510640 ,Guangdong ,Сhina)

By taking Prunus salicina cv. zaoshi as testing materials, the effects of various additives such as basic medium, 6-BA, ІBA,seed capsule, AgNO3, GA3, СH and AС on in vitro embryo culture of P. salicina cv. zaoshi were studied, and the system of mature P.salicina cv. zaoshi embryo culture was established. The optimal medium for germination and seedling was F14+6-BA 0.5 mg/L+ІBA 0.3mg/L+sugar 3%+agar 7g/L, which also was suitable for strong seeding; The optimal medium for shoot generation was F14+6-BA 1-2mg/L+ІBA 0.3mg/L+sugar 3%+agar 7g/L; The optimal medium for rooting was 1/2MS+ІBA 3mg/L+sugar 3%+agar7 g/L; While the decorticate of seed capsule was key factor which affected the germination of P. salicina cv. zaoshi embryo. The accessories of AgNO3,GA3, СH and AС that were only added to the additives were no effect on germination at all, but that all four accessories were added to the additives could increase the seeding rate.

Prunus salicina cv. zaoshi；embryo culture；induction of adventitious buds；proliferation

S722.1+9；S662.3

A

1673-923X (2012)05-0076-04

公益性行业(农业)科研专项(No.201003058)资助.

谢志亮(1982-)，男，硕士，助教，从事园艺植的组织培养、园艺植物栽培教学及生产技术推广工作；电话：(0577)88429211；E-mail: zlxie06@163.con

何业华(1960-)，博士，教授；电话：(020)85288262，E-mail：heyehua@hotmail.tom

[本文编校：欧阳钦]