高效液相色谱法检测糖化血红蛋白的方法学评价

张文华，侯晗宇，张建荣，王菊英，周立荣（宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川 750004）

糖化血红蛋白（HbA1c）作为糖尿病筛选、诊断、血糖控制、疗效评价的有效指标，在临床上已广泛使用，是监测糖尿病的金标准［1］，高效液相色谱法（HPLC）则被列为检测 HbA1c参考方法。本中心引进一台日本TOSOH公司HLC－723 G8全自动糖化血红蛋白分析仪，除用于测定HbA1c外，还可获得Hb A1、血红蛋白F（HbF）的值，现对其检测HbA1c性能进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本来源 乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血样本，来自本院门诊及住院患者。

1.1.2 仪器 日本TOSOH公司HLC－723 G8全自动糖化血红蛋白分析仪。

1.1.3 试剂 试剂（批号 EB－102S）、校准品（批号ZS0002）、质控品（批号100842），均为原装配套，由日本TOSOH公司提供。

1.2 方法 样本检测前均采用原公司提供的配套校准品进行校准，并用2个浓度水平的质控品进行控制，结果在控，手工操作步骤严格按照《全国临床检验操作规程》［2］进行。

1.2.1 精密度试验

1.2.1.1 批内试验 选取新鲜全血样本，含正常、异常浓度，分别测定HbA1c的含量，在一天内重复测定20次，计算变异系数。

1.2.1.2 批间试验 采用质控品，含正常、异常浓度，分别测定HbA1c的含量，每天上下午各测定1次，连续测定10 d，计算变异系数。

1.2.2 准确度试验 使用校准物在分析仪上连续进行10次分析，统计结果，计算结果均值与标定值的偏倚，偏倚应小于或等于3.0%。

1.2.3 携带污染率 取高浓度全血样本，混合均匀后连续测定3次，测定值分别为H1、H2、H3；再取低浓度全血样本，连续测定3次，测定值分别为L1、L2、L3。按公式计算携带污染率（≤3.0%）。携带污染率＝（L1－L3）×100%／（H3－L3）。

1.2.4 线性试验 （1）选取高值 HbA1c（18.1%）和低值HbA1c（4.7%）的人全血样品。（2）吸取20μL的高值样品注入样品管，加入4 mL（200倍稀释）溶血洗净液配制成样品A。（3）吸取20μL的低值样品注进样品管，加入4 mL（200倍稀释）溶血洗净液配制成样品B。（4）在分析仪上测定样品A和样品B，根据打印结果分别确认两个样品的色谱峰总面积（Total Area），该总面积表示HbA1c的浓度。（5）调整总面积，使样品A与样品B的色谱峰总面积相近，此时调整后样品B的浓度为4.6%。（6）按照100%、80%、60%、40%、20%、0%比例稀释混匀（B为稀释液），每个样品检测3次，对检测结果的均值和预期值进行直线回归统计。将实测值与理论值作比较（偏离应小于10%），计算y＝a x＋b，验证线性。（7）要求：a值在1±0.05范围内，相关系数r2≥0.95。

2 结 果

2.1 精密度试验 见表1。

2.2 准确度试验 见表2。

2.3 携带污染率 本次试验验证的携带污染率为1.09%，满足要求（≤3.0%）。

2.4 线性试验 将检测结果的均值和预期值进行直线回归统计。将实测值与理论值作比较（偏离应小于10%），计算y＝a x＋b，其中a＝0.9832，r2＝0.9922，满足要求（a值在1±0.05范围内，相关系数r2≥0.95）。

表1 精密度试验

表2 准确度试验－定值校准品

3 讨 论

HbA1c水平反映的是在检测前120 d内的平均血糖水平，而与抽血时间、患者是否空腹等因素无关，是监测糖尿病控制情况的良好指标［3］。

美国颁布的《临床实验室修正法案的最终法规》、ISO 15189医学实验室认可标准以及美国病理家学会（CAP）的认证标准［4-6］均要求实验室对引进或改变的检测系统进行性能验证后方可用于常规工作。全自动糖化血红蛋白分析仪HLC－723 G8基于高效液相色谱分析法的原理，通过阳离子交换柱利用电位差将血红蛋白组分分离。利用3种不同浓度洗脱液使包括HbA1c在内的多种血红蛋白进行梯度分离，分离成6个部分。经检测器检测分离后的各血红蛋白组分的吸光度，以百分率形式表示出各血红蛋白的组分结果与色谱图。作者通过测定全血中HbA1c的含量，从以下几个方面对该仪器性能进行综合评价。

3.1 精密度 批内变异系数小于1.0%，批间变异系数小于1.3%，符合CLIA′88对室间评估的允许误差要求，1／4允许误差范围为批内不精密度判断限（≤3.0%），1／3允许误差范围为日间不精密度判断限（≤4.0%），说明该仪器的重复性好，测定结果稳定。

3.2 准确度评价 分析厂商提供的HbA1c校准品，用校准品校准后，连续重复测定该批号校准品10次，统计结果，计算检测均值与标定值的偏倚，测试结果偏倚均小于3.0%，满足要求，说明该仪器准确性高。

3.3 其携带污染率小于或等于3.0%，样品间的交叉污染极小，满足检测要求。

3.4 通过线性试验，可观察各稀释点均呈现较好线性，a值及r2均满足要求，试验所验证项目的测量范围符合线性。综上所述，全自动糖化血红蛋白分析仪HLC－723 G8精密度高、准确性好、交叉污染极小，且具有良好线性等优点；另外，测试速度快、操作简便。为临床调整糖尿病治疗方案提供准确依据，有很好的应用前景。

［1］王笠，李琳.糖化血红蛋白的检测和临床应用［J］.上海医学检验杂志，2003，18（2）：119－121.

［2］叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程［M］.3版.南京：东南大学出版社，2006：223.

［3］纪立农，宁光.糖化血红蛋白［M］.北京：人民卫生出版社，2010：2－16.

［4］魏昊，丛玉隆.医学实验室质量管理与认可指南［M］.北京：中国计量出版社，2004：59－75.

［5］Department of Health and human Services，Centers for Medicare ＆ Medicaid Services.Clinical Laboratory improvement amendments of 1988：final rule［M］.Fed Register，2003：3704.

［6］毕波，吕元.定量检测方法学性能验证的系统设计［J］.中华检验医学杂志，2007，30（2）：143－145.