芫花的花粉形态观察及生活力和萌发率分析

刘 芳，汪 甜，王 杨，沈永宝

(南京林业大学，江苏 南京 210037)

芫花(Daphne genkwa Sieb.et Zucc.)别名南芫花、芫花条、药鱼草等，为瑞香科(Thymelaeaceae)瑞香属(Daphne L.)的多年生落叶小灌木。芫花的干燥花蕾是著名的中药材，具有利尿、镇咳、祛痰、抑菌、引产、抗肿瘤等功效［1］；另外，芫花花色艳丽、花团锦簇，具有良好的观赏性［2］。目前，关于芫花的研究主要集中在化学成分和药理作用方面［1，3－6］，也有少量关于其组织培养［7］、遗传多样性［8］、病虫害防治［9］等方面的研究报道，但对芫花的花粉形态及生理特性方面的研究尚未见报道。作者采用扫描电镜观察了芫花的花粉形态，并检测了其花粉生活力和萌发率，以期为芫花种质资源的利用和保护提供一定的实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

供试芫花花粉采自南京市江宁区铜山镇的丘陵地带。随机采集10株生长健壮的花枝，选取成熟花药，用体积分数4％戊二醛固定液(用体积分数25％戊二醛和磷酸配制)固定后，放入冰盒内带回实验室，用于扫描电镜观察；将剩余花枝直接带回实验室，用于花粉生活力测定和培养。

1.2 方法

1.2.1 花粉形态观察 用0.1 mol·L－1磷酸缓冲液(pH 7.2)清洗芫花花粉，用体积分数1％锇酸(采用0.2 mol·L－1磷酸缓冲液配制，pH 7.2)固定后，再用0.1 mol·L－1磷酸缓冲液清洗，依次经过体积分数30％、50％、70％、90％、100％乙醇系列脱水，分别用体积比为1∶1和1∶2的无水乙醇－乙酸异戊酯置换2次，再用纯乙酸异戊酯置换后，依次用HITACHI HCP－2型临界点干燥仪和HITACHIE－1010型离子溅射仪(日本日立公司生产)进行干燥和镀金，在FEIQUANTA－200型扫描电子显微镜(荷兰FEI公司生产)下观察并拍照。共观察3张制片，每张片选1个视野，每个视野统计50粒花粉的直径，计算平均值。

1.2.2 花粉生活力测定 采用TTC染色法检测芫花花粉生活力。随机选取经室温水培催花24 h的成熟花粉，混合均匀后用毛笔蘸取少许置于载玻片上，滴入体积分数0.1％TTC溶液1～2滴，盖上盖玻片，置于35℃恒温箱中在黑暗条件下染色5 h，然后用OLYMPUSCX－41型显微镜(日本奥林巴斯公司生产)观察并拍照。共观察3张制片，每片3个视野，统计每一视野中的花粉粒总数和染色花粉粒数，计算花粉生活力，结果取平均值。1.2.3 花粉萌发率测定 在10 g·L－1琼脂中分别添加50、100、150、200、250和300 g·L－1蔗糖，作为花粉培养基，以不添加蔗糖的10 g·L－1琼脂为对照。将培养基滴在凹面载玻片上，冷却后用毛笔蘸取适量花粉均匀撒在培养基上，将载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中，置于25℃［10］的培养箱中培养6 h左右至花粉管不再伸长、萌发率不再增加为止。以花粉管长度超过花粉粒直径作为花粉萌发的标准，统计花粉粒总数和已萌发的花粉粒数，计算花粉萌发率。每处理设3个重复，每一重复观察1个视野。

1.3 数据处理

花粉生活力和花粉萌发率的计算公式分别为：花粉生活力=(染色花粉粒数/花粉粒总数)×100％；花粉萌发率=(萌发的花粉粒数/花粉粒总数)×100％。利用SPSS 13.0分析软件对花粉萌发率的差异显著性进行分析。

2 结果和分析

2.1 芫花花粉的形态特征

芫花的花粉为单粒型，呈球形或近球形(图1－1)；直径15.6～21.6μm，平均直径19.1μm。花粉粒有萌发孔10～16个，近均匀分布于花粉粒表面，萌发孔呈不规则圆形(图1－2)，大小不一，孔径1.4～2.0μm。花粉粒表面纹饰为粗网状结构，表面观呈梅花形(图1－3)；网格呈近四边形至七边形(多为五至六边形)，网格的每个结点处膨大隆起，其基部呈近圆形或圆三角形，中部有1个乳突状小突起，结点间由呈“T”形或“Y”形的网脊连接。

图1 扫描电子显微镜下芫花花粉的形态特征Fig.1 Pollen morphology of Daphne genkwa Sieb.et Zucc.under SEM

2.2 芫花花粉的生活力分析

采用TTC法检测芫花花粉的生活力，花粉的染色情况见图2－1。统计结果显示，芫花花粉的生活力为51％，花粉管的长度最终可以达到花粉粒直径的10倍左右(图2－2)。此外，芫花花粉萌发时出现“群体效应”(图2－3)。芫花花粉粒有多个萌发孔，有些花粉粒出现2个以上萌发孔同时萌发的现象，但只有1个花粉管或无花粉管可以正常生长(图2－4)。

图2 芫花花粉生活力的观测结果Fig.2 Observation result of pollen viability of Daphne genkwa Sieb.et Zucc.

2.3 芫花花粉的萌发率分析

用含不同质量浓度蔗糖的培养基进行培养，芫花花粉的萌发率有明显差异，且蔗糖的质量浓度较高不利于芫花花粉的萌发。其中，在含50 g·L－1蔗糖的培养基中花粉的萌发率最高，为27.0％，显著高于对照(花粉萌发率6.2％)和其他处理组；在含100和150 g·L－1蔗糖的培养基中花粉萌发率差异不大，分别为10.7％和9.6％；在含200 g·L－1蔗糖的培养基中花粉萌发率较低，仅1.7％；培养基中蔗糖的质量浓度达到250和300 g·L－1，花粉不再萌发。

方差分析结果(F=6.178，n=6)显示：在含不同质量浓度蔗糖的培养基中芫花花粉的萌发率差异极显著(P＜0.01)。

3 结论和讨论

芫花花粉表面纹饰为粗网状结构，每个网格的网脊中部有向内的脊柱，顶部呈“T”形或“Y”形，常围成不规则的五至六边形或近圆形的网格；网格表面观呈梅花形，网眼深陷穿孔，在网格的交接处(结点处)有乳突状膨大的隆起，其基部呈近圆形或圆三角形，顶部则有1个乳突状小突起。而刘炳仑［11］将此类纹饰描述为网状－巴豆型，认为此网格由呈圆形、圆三角形的薄片组成，薄片之间由长短不一的棒(网脊)连接或无短棒连接。作者认为似有不妥。

通过TTC染色法和蔗糖离体培养法测得的芫花花粉生活力和萌发率均不高，可能是因为芫花花粉粒网眼多且大，使得花粉易失水变形，从而丧失生活力；此外，在花粉采集过程中，多风和干燥的天气也加速了花粉生活力的丧失。通过这两种方法测得的花粉生活力也有很大差异，其中，用TTC染色法检测时花粉着色深浅变化较大，仅靠肉眼判断易造成实验数据偏高；而用蔗糖离体培养时一部分具有生活力的花粉不一定能够萌发，使得实验数据偏低。

蔗糖具有调节渗透势、促进花粉萌发的作用。用于芫花花粉萌发的最佳蔗糖质量浓度为50 g·L－1，此结果与张亚利等［12］的研究结果一致。在蔗糖质量浓度高于100 g·L－1的条件下，花粉萌发率随蔗糖质量浓度的提高而下降，可能是由于高质量浓度的蔗糖改变了花粉管的细胞透性，对花粉萌发不利。此外，芫花花粉萌发过程中还出现了多个萌发孔同时萌发的现象，目前花粉萌发2个以上花粉管的现象很少见［13］，有关花粉粒萌发多个花粉管的机制还有待进一步研究和探讨。

［1］张保献，原思通，张静修，等.芫花的现代研究概况［J］.中国中医药信息杂志，1995，2(10)：21－24.

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［3］张保献，原思通，张静修，等.芫花的现代研究概况(续)［J］.中国中医药信息杂志，1995，2(11)：11－13.

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