春季和秋季莓叶委陵菜叶片和地下部分芦丁及儿茶素含量的HPLC分析

周 栋，马蓓蓓，刘汉柱，辛 华

(青岛农业大学，山东青岛266109)

莓叶委陵菜(Potentilla fragarioides L.)又名雉子筵，为蔷薇科(Rosaceae)委陵菜属(Potentilla L.)多年生草本植物，具有补阴虚、止血、抗病毒等作用，由其制成的莓叶委陵菜胶囊在临床上用于治疗月经过多、功能性子宫出血及子宫肌瘤出血等症［1－2］。迄今为止，对莓叶委陵菜其他方面的研究鲜有报道，仅对其染色体数进行了研究［3］。委陵菜属植物普遍含有多种活性成分［4－5］，如黄酮类、鞣质类、萜类等；该属植物委陵菜(P.chinensis Ser.)可用于治疗赤痢腹痛、久痢不止、痔疮出血、臃肿疮毒等症［6］。

植物所含的黄酮类成分能有效保护植物抵抗紫外线照射和病菌侵染［7］，已作为主要药用成分广泛用于临床医疗。芦丁和儿茶素均属于黄酮类成分，其中，芦丁具有抗癌、消炎、抗氧化等多种生物活性，已广泛应用于临床，近年来还用于治疗老年性脑部疾病、抑制神经胶质瘤增生等［8－9］；儿茶素则具有抗细菌、抗病毒、抗真菌、抗毒素等作用［10］，还具有抑制血压及血糖、降低血液中的胆固醇含量、预防癌症和心血管疾病等作用［11］。

作者分别对采自春季和秋季的莓叶委陵菜叶片和地下部分的芦丁和儿茶素含量进行测定和比较，以期为莓叶委陵菜的合理开发和药用资源的有效利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试莓叶委陵菜分别于2009年11月5日和2010年5月7日采自山东省烟台市昆嵛山。将叶片与地下部分分开，洗净阴干后粉碎并过60目筛，备用。

所用仪器有Agilent1100型高效液相色谱仪(美国Agilent科技有限公司生产)、FZ 102型微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司生产)和KQ 3200 DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司生产)。

芦丁标准品(批号：100080－200707)和儿茶素标准品(批号：877－200001)均购自中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，乙酸为分析纯，水为超纯水(电阻率为18 MΩ·cm)。

1.2 方法

1.2.1 HPLC色谱条件 Eclipse XDB C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为体积分数1％乙酸和甲醇。芦丁采用梯度洗脱法，洗脱程序：0～40min，V(1％乙酸)∶V(甲醇)=95∶5；40～50 min，V(1％乙酸)∶V(甲醇)=70∶30；50～52 min，V(1％乙酸)∶V(甲醇)=55∶45；52～57 min，V(1％乙酸)∶V(甲醇)= 0∶100；57～62 min，V(1％乙酸)∶V(甲醇)=95∶5。儿茶素采用非梯度洗脱法，流动相为V(1％乙酸)∶V(甲醇)=55∶45。柱温30℃，流速1.0 mL·min－1，进样量20μL。光电二极管阵列检测器，芦丁和儿茶素的检测波长分别为254和280 nm，出峰时间分别为43.767和12.557 min。

1.2.2 标准品溶液制备和标准曲线绘制 精确称取芦丁标准品4.10 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL(质量浓度为0.41 mg·mL－1)，摇匀后吸取1 m L并用甲醇定容至50 m L，得到质量浓度8.20μg·mL－1的芦丁标准品溶液。精确称取儿茶素标准品3.30 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到质量浓度0.33 mg·mL－1的儿茶素标准品溶液。

根据预实验结果，莓叶委陵菜叶片中的芦丁含量分别比地下部分高30和50倍，为降低误差，绘制2条芦丁标准曲线(方程1和方程2)，分别用于叶片和地下部分芦丁含量的测定。将0.41 mg·mL－1芦丁标准品溶液分别稀释15、12、8、4和2倍，将8.20μg·mL－1芦丁标准品溶液分别稀释25、16、8、4和2倍，按上述HPLC色谱条件分别依次进样测定，并以芦丁质量浓度为自变量x、峰面积为因变量y分别对方程1和方程2进行拟合。线性回归方程1为：y=16.383 0x+66.258 0，R2=0.997 1，线性范围27.33～210.00μg·mL－1；线性回归方程2为：y=14.142 0x－0.894 5，R2=0.995 7，线性范围0.34～4.10μg·mL－1。

将0.33 mg·mL－1儿茶素标准品溶液分别稀释25、20、15、10和4倍，按上述HPLC色谱条件依次进样测定，并以儿茶素质量浓度为自变量x、峰面积为因变量y对儿茶素标准曲线方程进行拟合，线性回归方程为：y=4.624 4x+10.902 0，R2=0.996 7，线性范围13.20～82.50μg·mL－1。

1.2.3 样品溶液制备和HPLC分析 分别称取各样品粉末1.50 g，加入25 mL甲醇和水的等体积混合溶液，称取质量后浸泡1 h，然后超声处理(30℃，40 kHz)1 h，冷却至室温后用甲醇和水的等体积混合溶液补足至浸泡前质量，用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液即为样品溶液，按上述HPLC色谱条件进样分析，并根据各标准品曲线计算样品中芦丁和儿茶素含量。

1.2.4 方法学考察 取8.20μg·mL－1芦丁标准品溶液按上述HPLC色谱条件重复进样测定6次，检测仪器的精密度。芦丁峰面积的RSD为0.81％，表明仪器精密度良好。

取莓叶委陵菜春季叶片和秋季地下部分样品溶液，按照上述HPLC色谱条件分别于0、2、4、6和8 h进样分析，检测样品溶液的稳定性。样品溶液中芦丁与儿茶素峰面积的RSD分别为1.30％和1.45％，表明样品溶液在8 h内稳定。

取已知芦丁含量的莓叶委陵菜春季叶片样品6份，每份1 g，分别精密加入0.41 mg·mL－1芦丁标准品溶液150μL；取已知儿茶素含量的莓叶委陵菜秋季地下部分样品6份，每份1 g，分别精密加入0.33 mg·m L－1儿茶素标准品溶液1.0 mL；按上述样品溶液制备方法和HPLC色谱条件分别提取测定，每份样品重复进样3次，检测该方法的加样回收率。样品溶液中芦丁的平均回收率为97.10％、RSD为1.96％；儿茶素的平均回收率为96.4％、RSD为1.83％。

1.3 数据处理

利用DPSV7.05软件对实验数据进行LSD检验。

2 结果和分析

春季和秋季莓叶委陵菜叶片和地下部分的芦丁与儿茶素的平均含量见表1，所有测定值的RSD均小于3.0％。由表1可见，春季莓叶委陵菜叶片和地下部分的芦丁含量均显著高于秋季(P＜0.05)，春季叶片和地下部分的芦丁含量分别是秋季的2.85和5.08倍。秋季叶片中儿茶素的含量显著高于春季(P＜0.05)，达到2.98倍；而秋季地下部分的儿茶素含量则显著低于春季(P＜0.05)，仅为春季的50.64％。

由表1还可见，不论是春季还是秋季，莓叶委陵菜叶片中的芦丁含量均显著高于地下部分(P＜0.05)，春季和秋季叶片中的芦丁含量分别是地下部分的30.70和54.85倍。莓叶委陵菜各部位儿茶素含量的季节变化则与芦丁不同，春季地下部分的儿茶素含量显著高于叶片(P＜0.05)，是叶片的2.75倍；而秋季地下部分的儿茶素含量则显著低于叶片(P＜0.05)，仅为叶片的46.72％。

表1 春季和秋季莓叶委陵菜叶片和地下部分芦丁和儿茶素的含量1) Table 1 Contents of rutin and catechin in leaves and under-ground part of Potentilla fragarioides L.in spring and autumn1)

3 讨论和结论

近年来，在黄酮类成分含量的测定方法中HPLC方法［12］是比较先进的测定方法之一。因此，作者利用该方法测定了莓叶委陵菜叶片及地下部分芦丁和儿茶素2种黄酮类成分的含量，并对这2种成分在春季和秋季的季节差异进行了比较。该方法简便易行，重现性和线性关系良好，回收率较高，结果可靠。

测定结果显示，莓叶委陵菜叶片中的芦丁含量较地下部分高，尤其是春季叶片的芦丁含量最高，因此，若以获取芦丁单体为目的，从充分利用资源的角度考虑，应采集莓叶委陵菜的叶片，特别是春季的叶片。莓叶委陵菜秋季叶片的儿茶素含量最高，因此，若以提取儿茶素单体为目的，从资源利用的角度考虑，应采集莓叶委陵菜秋季叶片为宜。通过本实验可以看出，莓叶委陵菜叶片和地下部分芦丁与儿茶素含量都比较丰富，其同属植物委陵菜和翻白草(Potentilla discolor Bunge)的药用功效已很明确［4，13］，因此，推测莓叶委陵菜也应具有相似的药用价值。

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