雷帕霉素和LY294002对游泳训练大鼠骨骼肌生长及PI3K/Akt/m TOR信号通路的影响

史仍飞,胡莉莉,李志刚,魏安奎,张 平,袁海平

雷帕霉素和LY294002对游泳训练大鼠骨骼肌生长及PI3K/Akt/m TOR信号通路的影响

史仍飞,胡莉莉,李志刚,魏安奎,张 平,袁海平

目的:探讨LY294002和Rapamycin对运动性骨骼肌PI3K/Akt/m TOR上游信号通路抑制效应,为骨骼肌生长的分子机制提供实验依据。方法:以40只成年SD大鼠为对象,采用负重15%间歇游泳训练方式建立运动模型。动物分组为安静对照组(C),运动组(T),运动+LY294002组(TL),运动 +Rapamycin组(TR),运动 +LY294002+Rapamycin组(TRL)。取左、右侧腓肠肌和比目鱼肌,采用 westren blotting技术检测骨骼肌 Akt、PI3K、m TOR及其磷酸化水平。结果:8周训练后,各实验组骨骼肌质量无显著性差异(P>0.05),但 T组腓肠肌和比目鱼肌肉质量指数均显著高于对照组。与对照组相比,T组大鼠骨骼肌P-PI3K/PI3 K、P-Akt/Akt、P-m TOR/m TOR比值略增加(P>0.05),但 TR、TLR组均有显著下降(P<0.05)。结论:间歇性游泳负荷训练能够促进骨骼肌生长,且与 PI3K/Akt/ m TOR信号通路有关。LY294002和Rapamycin对运动引起的PI3K/Akt/m TOR信号通路有抑制作用。

骨骼肌;雷帕霉素;运动;鼠;动物实验

骨骼肌占人体总重量的40%～50%,是人体最重要的运动器官,也决定着机体整体代谢的效率[17,11]。近年来的一些研究表明,骨骼肌的质量和健康状况与慢性疾病的预防及改善生活质量有着密切关系。在骨骼肌的生长过程中,运动或机械负荷是重塑骨骼肌、促进肌肉生长及延缓衰减的重要手段,缘于运动或机械刺激使骨骼肌发生一系列适应性的变化,如肌肉的能量代谢增强、激素水平的改变、蛋白质合成能力的提高等,且认为这种适应变化与相关信号通路有关[19]。

就骨骼肌响应运动或机械刺激而言,一些研究认为,外界的机械信号刺激促进胰岛素样生长因子(IGF-1)的释放,进而通过生物信号传导通路来实现。一个重要的控制肌肉质量的信号蛋白是 mammalian target of rapamycin (m TOR),m TOR被认为是胰岛素/生长因子信号以及其他各种信号的交汇点,且受细胞的能量状态、氨基酸及营养物质和机械信号等影响[7,18]。近期的一些研究不但认为肌肉蛋白的合成与m TOR信号有关,并且也认为m TOR是肌肉生长及肥大所必需的。那么,运动或机械刺激引起的肌肉生长及肥大是否也受这一通路的影响?尽管一些研究认为,运动尤其是抗阻力量练习后,肌肉质量和力量都显著性增加,且m TOR等相关蛋白表达也增强,但运动对肌肉生长及 PI3K/Akt/m TOR信号通路的影响还不是很明确。因此,为进一步探讨运动对PI3K/Akt/m TOR通路的影响,本研究通过游泳负荷建立大鼠运动模型,采用 PI3K抑制剂(LY294002)和m TOR抑制剂(Rapamycin)干预,探讨LY294002和 Rapamycin对运动干预后的 PI3K/Akt/ m TOR上游信号通路的抑制效应,为进一步丰富骨骼肌肥大的分子机制提供实验依据。

1 实验对象与方法

1.1 实验动物及饲养

40只健康雄性Sp rague-Daw ley大鼠,体重240～260 g (由第二军医大学实验动物中心提供),标准啮齿类动物饲料喂养,自由进食饮水。室温保持在20℃～22℃,相对湿度45%～55%,光照时间为12 h/d。游泳训练设备为水深80 cm,水温保持32℃左右的水槽,平均每只大鼠活动空间不少于200 cm2。

1.2 动物分组及训练方案

SD大鼠适应性饲养一周,将大鼠随机分为5组:安静对照组(C组);运动组(T组);运动+LY294002组(TL组);运动 +Rapamycin组(TR组);运动+LY294002+ Rapamycin组(TRL组),每组8只,运动方案均采用负体重15%间歇游泳训练方式,训练隔日进行,时间30 min。实验开始阶段,TL组、TR组和 TRL组隔日肌肉注射抑制剂LY294002(0.25μg/100 g体重)和 Rapamycin(0.1μg/ 100 g体重),连续注射2周,T组注射同样体积的抑制剂稀释液。

1.3 主要仪器及试剂

1.3.1 仪器

台式高速离心机,德国IKA-T10 basic组织匀浆机,722型分光光度计,Horfer电泳仪和转膜仪,Eppendorf低温高速离心机,BIO-RAD 550酶标仪。动物游泳训练水槽。

1.3.2 试剂

PI3K抗体和磷酸化 PI3K p85(Tyr458)抗体,Akt抗体及磷酸化Akt,m TOR抗体及磷酸化m TOR(Ser2448)抗体(美国Cell Signaling公司);GAPDH(康城生物);辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗羊 IGG(美国 Amersham Biosciences公司);BCA蛋白测定试剂盒(碧云天生物公司);蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂 &PMSF(康城生物); LY294002和雷帕霉素(Rapamycin;碧云天生物),ECL发光试剂(碧云天生物)。

1.4 样本采集及检测

末次运动训练结束后,空腹过夜取材,称重,以10%水合氯醛(35～40 mg/100 g体重)腹腔麻醉,无菌条件下取大鼠左右两侧腓肠肌和比目鱼肌,4℃预冷的生理盐水清洗,滤纸吸干肌肉组织表面的水分并称重,液氮速冻后转至-80℃保存待测。

1.5 肌肉蛋白提取及Western blotting检测

取约200 mg肌肉组织,置于试管中,加入1 ml组织裂解液,其中每1 ml裂解液含5μl的磷酸酶抑制剂、5μl的蛋白酶抑制剂和5μl的 PMSF。剪碎肌肉,4℃中静置30 min。玻璃研磨器将肌肉组织充分匀浆,移至1.5 m l离心管中。4℃低温高速离心机以12 000 rpm离心10 min,取上清。肌肉总蛋白含量测定采用BCA法。

Western blotting分析:取已定量蛋白,按1∶4的体积比加入4x protein loading buffer,沸水煮10 min,待用。电泳上样量为15μl,浓缩胶电压为60 V,待蛋白样品中的溴酚蓝至浓缩胶与分离胶的交界处时(约1.5 h),电压调至100～120V(约3 h)。转膜电压100 V,小分子量蛋白转膜时间约2 h,大分子量蛋白约4 h。5%脱脂奶粉封闭1 h。一抗孵育,抗体用1%BSA稀释至(1∶1 000),摇床4℃孵育过夜。二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗羊 IGG(1∶6 000),摇床上孵育1 h。化学发光,显影、定影。将 X光片扫描成图像并保存为电脑文件,用 Image J分析软件读取图片上目的条带光密度值。

1.6 统计方法

数据采用 SPSS 13.0统计软件处理。实验结果用均值±标准差±S)表示,采用方差分析,以P<0.05为显著性差异。

2 结果

2.1 各实验组大鼠体重、肌肉质量指数的变化

8周实验结束后,与对照组(C组)相比,各运动组大鼠体重均显著降低(P<0.05),但各运动组组间无显著性差异。肌肉质量为左右两侧比目鱼肌和腓肠肌质量之合,TR组和TRL组大鼠肌肉质量分别显著低于C组和 T组(P< 0.05)。腓肠肌质量指数(腓肠肌质量与体重之比)显示,与C组相比,T组和 TL组均显著增加(P<0.05),TR组和TRL组无显著性差异,但显著低于 T组(P<0.05)。

比目鱼肌质量指数显示,T组显著高于 C组(P< 0.05),且也显著高于其他运动组(P<0.01)。说明8周的运动训练显著提高了大鼠肌肉的相对质量,而抑制剂在一定程度上抑制运动诱导的肌肉生长(表1)。

表1 本研究各组实验大鼠体重、肌肉质量及肌肉质量指数一览表Table 1 Body Weight,Muscle Massand Muscle Mass Index in Rats (X ±SD)

2.2 抑制剂对运动训练大鼠骨骼肌PI3K/Akt/m TOR信号通路蛋白的影响

本研究采用大鼠体重的15%作为游泳运动的负荷,并分别及联合使用抑制剂Rapamycin与LY294002,检测骨骼肌PI3K、Akt、m TOR及其活性形式。图1a结果显示,各实验组p-PI3K电泳条带并无明显的差异,图 1b中p-PI3K/PI3K比值的分析发现,TR、TRL组均显著低于 T组(P<0.05);图1c显示,p-Akt/Akt比值 TR和 TRL组均显著低于运动组(P<0.05)。各实验组p-m TOR活性显示(图2a),TL、TR和 TRL组的光密度值明显低于运动组和安静组,且从图2b的p-m TOR/m TOR比值分析,均与 T组有显著性降低(P<0.05)。从图1和图2可知, PI3K的特异抑制剂LY294002有效地降低了 TL组的p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt比值,但没有显著性差异,仅引起m TOR/m TOR的比值显著降低(P<0.05)。另外,本部分结果中最明显的变化是 Rapamycin干预组及 Rapamycin与LY294002联合干预组,即 TR、TRL组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR比值均有显著下降 (P< 0.05)。

图1 各实验组大鼠PI3K、Akt及其磷酸化形式的 western boltting结果示意图Figure 1. PI3 K,Akt and Their Phosphorglation Blots in Groups

图2 各实验组大鼠m TOR及磷酸化形式的 western boltting结果示意图Figure 2. m TOR and Its Phosphorglation Blots in Groups

3 分析与讨论

3.1 游泳负荷训练对骨骼肌质量的影响

骨骼肌在人体运动和整体代谢方面发挥重要作用,也是占体重最大的器官之一。大量研究表明,维持骨骼肌质量有助于预防疾病和改善生活质量,运动或机械负荷、细胞因子、生长因子和激素等会影响骨骼肌质量[17,11],但相关的分子机制还需要进一步的探讨。

骨骼肌的生长及肥大是肌肉对负荷做出的一种适应性反应,抗阻运动是获得肌肉肥大最好的训练方法之一,而骨骼肌肥大主要归因于肌纤维横断面的增加或骨骼肌内诸多成份的增加等。通常采用抗阻力量训练、电刺激、举重力量练习、牵张负荷训练、游泳负重等方案[5,4],建立骨骼肌肥大模型,常采用的评价指标有肌纤维横截面积、肌肉质量、骨骼肌质量指数、骨骼肌蛋白含量等。Adams等[3]研究发现,不同的刺激方式均引起骨骼肌肥大,表现为骨骼肌质量指数增加,同时 IGF-1的mRNA表达增强。本研究采用游泳负荷训练方案,借鉴 Trada等[20]训练方案,以负重游泳间歇训练建立动物模型,关于负荷游泳实验对大鼠肌肉生长的影响方面,Dimauro等[8]对大鼠采用高强度间歇游泳训练(尾部负重,递增负荷至7%的体重)和雄性激素干预5周,研究发现,运动与雄性激素分别增加酵解氧化型肌纤维比例,同时降低快肌肉纤维比例;而高强度间歇游泳训练与雄性激素联合干预,则促进肌纤维肥大。对于一次性高强度间歇游泳训练对骨骼肌的影响,目前文献主要涉及到运动后骨骼肌对胰岛素效应的影响,相对于长时间的耐力游泳运动,同样也促进胰岛素效应,提高肌肉吸收血糖的能力,也对Akt及AMPK等信号蛋白产生效应[16,15],从而有利于运动后蛋白质合成代谢,这也可以间接作为本研究的一些证据。本研究在预实验的基础上,通过增加的游泳负重方式,采用间歇、高强度的运动训练方式达到实验的要求。8周训练后大鼠骨骼肌质量指数显著高于安静训练组和非负重训练组,这一结果与 Trada及Adams等[3,20]研究结果类似。游泳训练后,骨骼肌质量指数增加,肌肉质量指数是相对容易测量,也能够准确反映肌肉相对肥大的指标,很多相关文献中均采用这一简单的指标。在本研究中各实验组进食情况相同,是否与负重游泳训练促进了肌肉蛋白合成相关的信号表达有关。

3.2 运动对PI3K/Akt/m TOR信号通路的影响

最近的一些研究表明,骨骼肌的适应性变化与m TOR活性密切,如机械负荷诱导的肌肉肥大,伴随着m TOR活性信号的增强;而疾病、糖皮质激素、食物剥夺引起的肌肉萎缩,则与m TOR信号蛋白活性降低有关,也即表明在骨骼肌的生长及肥大方面,受一系列与m TOR相关的信号通路影响[1,2]。

PI3K/Akt/m TOR信号通路与细胞凋亡、遗传信息的转录、翻译以及细胞周期的调控等密切相关,受 IGF-1、激素及机械负荷的影响[2]。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,具有Ser/Thr(丝氨酸/苏氨酸)激酶的活性,也具有磷脂酰肌醇激酶的活性,是许多生命活动中关键的信号分子。Akt是PI3K下游直接的靶蛋白,其具有丝氨酸/苏氨酸残基,可直接被 PI3K激活。在 PI3 K途径中,当上游信号刺激细胞膜表现时,穿膜受体酪氨酸激酶自磷酸化或磷酸化其他底物后,可在细胞膜内表面产生PI3K结合位点, PI3K结合后可产生一些磷脂,激活其下游的Akt,活化的Akt(p-Akt)可介导各种类型的细胞生长、生存和分化[10]。m TOR整合细胞内外多种信号刺激,转导至下游至少2个独立靶蛋白,即S6K1和4E-BP1/eIF-4E在调节哺乳动物细胞时控制翻译,参与体内多条信号通路,影响转录及蛋白质合成。在此通路中,LY294002是 PI3K抑制剂; m TOR的抑制剂为雷帕霉素(Rapamycin),是一种亲脂性大环内酯物,能特异性抑制m TOR激酶活性[12]。

在肌肉蛋白合成的信号途径方面,该通路起着重要作用。本研究为探讨这一通路在肌肉肥大中的作用,分别通过肌肉注射PI3K的专一抑制剂LY294002和m TOR的抑制剂雷帕霉素(Rapamycin),结果显示,LY294002抑制了PI3K的磷酸化活性,同时直接或间接抑制 Akt的活性。同样,Rapamycin抑制m TOR磷酸化活性形式;合并使用两种抑制剂后,PI3K和m TOR磷酸化活性均下降,同时也表现为骨骼肌质量指数下降,也即运动引起的肌肉肥大被抑制。在已有的研究中,Fingar等[9]发现,哺乳动物细胞生长到适当大小需要依赖 m TOR及 PI3K信号转导。Zhou等[21]研究用PI3K和m TOR的抑制剂进行细胞治疗可以阻滞蛋白质合成和细胞生长。而与运动或机械刺激相关的文献提示,运动或机械负荷通过 PI3K/Akt/m TOR信号通路促进m TOR磷酸化活性,但并没有证明这一途径与肌肉肥大的直接关系。根据 Hormberger等 (2004[14], 2006[13])、Bodine(2006[6])的文献结论,机械负荷能够通过m TOR信号诱导肌肉肥大。另外也有研究发现,在肌肉废用性萎缩过程中,Akt/m TOR信号通路活性下降,而激活这条通路可以降低肌肉萎缩的程度。同时结合本研究的结果,足以证明本研究的设想,即运动通过信号通路促进肌肉生长及肥大,而相应的抑制剂会阻断运动训练的效应。

4 小结

间歇性游泳负荷训练能够提高大鼠的骨骼肌质量;骨骼肌肥大与 PI3K/Akt/m TOR信号通路有关,LY294002和Rapamycin的使用对运动引起的PI3K/Akt/m TOR信号通路有抑制作用。

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Effects of Rapamycin and LY 294002 on the PI3K/Akt/m TOR Pathway in Rat Skeletal M uscle with Swimm ing Train ing

SH IReng-fei,HU Li-li,L I Zhi-gang,W EIA n-kui,ZHANG Ping,YUAN Hai-ping

Objective:To examine the association between the PI3 K/Akt/m TOR pathway and the skeletal muscle grow th and its potential mechanism responding to swimming training. Methods:40 male SD rats were divided into control group(C)and training group(T),and used to establish swimming training models with a 15%weight load.The training adopted interval training protocol with load and training every other day with 8 weeks.The gastrocnemius and soleus muscle were collected and weighed after training,and the protein expression of PI3 K,Akt,m TOR and their activated forms were examined.Results:After 8 weeks treatment,no significant was observed in skeletal muscle mass between groups,but the Soleus and Gastrocnemius Muscle Mass Index in training T group increased significantly compared with control group(P<0.05).Compared with the control group,the ratio of P-PI3K/PI3 K,PAkt/Akt,P-m TOR/m TOR in T group increased with insignificant difference,but the ratio in TR and TRL groups was significantly reduced(P<0.05).Conclusions:these results suggest that the interval training protocol is helpful to increase the relative muscle hypertrophy, LY294002 and Rapamycin has an inhibition role in the PI3 K/Akt/m TOR pathway responding to training.

skeletalmuscle;Rapamycin;exercise;rat;animalexperiment

G804.2

A

1000-677X(2011)07-0062-05

2011-03-11;

2011-06-11

国家自然科学基金青年项目(30800542)和上海市第二期重点学科建设项目(S30802)。

史仍飞(1976-),男,安徽砀山县人,副教授,博士,研究方向为运动与骨骼肌适应、运动营养,Tel:(021) 51253247,E-mail:rfeishi@yahoo.com.cn;胡莉莉(1987-),女,广西桂林人,在读硕士研究生,E-mail:hulili1987222@163.com;李志刚 (1986-),男,山东潍坊人,在读硕士研究生,研究方向为运动生理专业;魏安奎(1966-),男,安徽青阳人,副教授,博士,Tel:(021) 51253246,E-mail:weiankui@sus.edu.cn;张平(1961-),女,湖北武汉人,实验师,Tel:(021)51253249;袁海平(1959-),女,上海人,副教授,硕士,研究方向为运动营养,E-mail:yuanhaiping6666@yahoo.com.cn。

上海体育学院运动科学学院,上海200438

School of Kinesiology,Shanghai University of Sport, Shanghai 200438,China.