提高产朊假丝酵母富硒能力的工艺条件研究

王大慧 杨 波 卫功元 丁志娟

（苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215123）

提高产朊假丝酵母富硒能力的工艺条件研究

王大慧 杨 波 卫功元 丁志娟

（苏州大学基础医学与生物科学学院，江苏 苏州 215123）

在5L发酵罐水平上研究不同培养条件对富硒产朊假丝酵母细胞生长、谷胱甘肽合成和富硒能力的影响，通过分批发酵试验确定较优的培养方案：在发酵培养的第18小时加入20mg／L亚硒酸钠，发酵罐转速450r／min，L－蛋氨酸的添加浓度10mmol／L。该条件下，酵母细胞干重为11.32g／L，胞内谷胱甘肽和有机硒含量分别达到11.5mg／g和1 352μg／g，该方案为高性能（高胞内谷胱甘肽含量、高有机硒含量）富硒产朊假丝酵母的高效制备奠定了基础。

产朊假丝酵母；有机硒；谷胱甘肽

谷胱甘肽（GSH）是存在于细胞内最丰富的小分子硫醇类化合物［1］，对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用［2］。硒是生物体内谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）的重要组成部分，而GSH－Px可以分解生物体内的有害过氧化物，清除自由基，防止细胞膜氧化受损［3］，硒还具有保护心脏、维持心血管系统正常结构和功能的作用［4－5］。1973年，硒被世界卫生组织确定为人体必需的微量元素。

硒的摄入可以明显降低癌症的发生率［6］，硒的补充可以通过摄入无机硒或有机硒得以实现。无机硒毒性较高，因而限制了其使用范围；有机硒虽然安全性能和利用率较高，但常用的硒代蛋氨酸价格昂贵，因此有必要寻找一种廉价的有机硒产品及其生产方法。利用微生物如产朊假丝酵母将无机硒生物转化为有机硒被认为是一条安全高效的途径［7］。作为一种安全可靠（GRAS）生物，产朊假丝酵母已经被美国FDA认证，可作为食品添加剂的酵母，并能运用于食品和制药行业。中国农业部于1999年6月就已将产朊假丝酵母确定为12种微生物饲料添加剂之一。

在富硒酵母的发酵法制备过程中，营养条件以及培养环境等因素都对酵母细胞富硒能力产生重要影响。中国已有学者对这些因素进行研究［7－10］，但大都集中在摇瓶水平上，鲜有在发酵罐水平上的研究报道。此外，由于GSH的生理学意义，胞内富含GSH的富硒酵母将更具有应用价值［7］。本试验以一株能够在胞内积累GSH的产朊假丝酵母作为出发菌株，以富硒酵母的高性能（高GSH含量、高有机硒含量）为目标，通过研究分批发酵过程中影响酵母细胞生长、GSH合成和富硒能力的因素，奠定高性能富硒酵母的制备为基础。由于此种酵母在补充硒的同时还能够提高机体的免疫力，因此在食品、医药、保健品和饲料添加剂等多种领域都将具有更为广阔的市场和应用前景。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

产朊假丝酵母（Candida utilisSZU 07－01）：苏州大学微生物工程实验室保藏。

1.1.2 培养基

种子培养基：葡萄糖20.0g／L，蛋白胨10.0g／L，酵母膏10.0g／L，pH 6.0；

发酵培养基：葡萄糖30.0g／L，硫酸铵8.0g／L，磷酸二氢钾3.0g／L，硫酸镁0.25g／L，pH 5.5。

1.1.3 仪器和试剂

搅拌式发酵罐：BIOTECH－5BGZ，上海保兴生物设备工程有限公司；

恒温摇瓶柜：HZ－2010K，太仓市华利达实验仪器设备公司；

高压蒸气灭菌锅：LDZX－50KBS，上海申安医疗器械厂；

超净工作台：SW－CJ－2A，吴江市龙宏净化设备有限公司；

离心机：LD4－2A，北京医用离心机厂；

分析天平：JA2003，上海天平仪器有限公司；

722型分光光度计：T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司；

5，5’－二硫－双（2－硝基苯甲酸）（DTNB）、NADPH 和谷胱甘肽还原酶：美国Sigma公司；

其它试剂：均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 一级种子培养 将斜面种子活化4h后接入50mL种子培养基中，培养24h，培养温度30℃，摇床转速为200r／min。

1.2.2 二级种子培养 将一级种子按10%（V／V）的接种量接入种子培养基（50mL／500mL），培养20h，培养温度30℃，摇床转速为200r／min。

1.2.3 发酵罐发酵培养 全自动5L搅拌式发酵罐中装发酵培养基3L，接种量10% （V／V），温度27℃，pH 5.5，通气量3.0L／min，发酵时间30h。除非特别说明，搅拌转速为400r／min。pH采用梅特勒电极在位检测，通过自动流加3mol／L H2SO4或3mol／L NaOH溶液进行调节以维持pH变化在±0.02以内。发酵结束检测细胞干重、GSH含量和有机硒含量等指标。

1.3 分析方法

1.3.1 葡萄糖浓度的测定 3，5－二硝基水杨酸法［11］。

1.3.2 细胞干重（DCW）的测定 取20mL发酵液，3 500r／min离心10min，蒸馏水离心洗涤3次，收集菌体，70℃烘干至恒重称重，计算出细胞干重。

1.3.3 胞内GSH含量的测定 DTNB－谷胱甘肽还原酶循环法［11］。

1.3.4 细胞内无机硒、总硒含量的测定 见文献［11］。

1.3.5 胞内有机硒含量的计算 见式（1）。

有机Se含量（μg／g）＝［胞内总Se含量（μg／L）－胞内无机Se含量（μg／L）］酵母细胞干重（g／L） （1）

2 结果与分析

2.1 C. utilis SZU 07－01生长曲线

在5L发酵罐水平上首先考察了C.utilisSZU 07－01细胞的生长和代谢情况。由图1可知，在酵母细胞培养15h时，葡萄糖基本消耗完毕，细胞干重在18h达到最大值13.05g／L，胞内 GSH在27h达到133.3mg／L。在这些时间点的基础上，以下考察不同时间添加Na2SeO3对富硒产朊假丝酵母性能的影响。

图1 C. utilis SZU07－01分批培养过程曲线Figure 1 Time－course of batch culture process with C. utilis SZU 07－01

2.2 Na2SeO3添加时间对富硒酵母制备的影响

根据C.utilisSZU07－01菌株生长的特点，分别在培养过程中的不同时间添加15mg／L 的 Na2SeO3，27 ℃、400r／min下培养30h，考察富硒酵母的生长和代谢变化情况，结果见图2。由图2可知，发酵开始阶段添加Na2SeO3对细胞生长、GSH合成和有机硒转化均产生不利影响。综合考虑，在18h添加Na2SeO3较为合适，此时细胞干重为10.87g／L，胞内GSH含量和有机硒含量分别为11.0mg／g和983μg／g。

图2 Na2SeO3添加时间对富硒酵母制备的影响Figure 2 Effect of Na2SeO3addition time on the preparation of selenium－enriched yeast

2.3 Na2SeO3浓度对富硒酵母制备的影响

在发酵培养的18h添加不同浓度的Na2SeO3，27℃、400r／min下培养30h，考察富硒酵母的生长和代谢变化情况。结果见图3。由图3可知，当 Na2SeO3浓度低于20mg／L时，其添加只对细胞生长和GSH合成产生轻微影响，但明显提高了胞内有机硒含量。而当Na2SeO3浓度大于25mg／L时，胞内GSH含量、有机硒含量大幅度下降。因此，确定Na2SeO3的添加浓度为20mg／L。

图3 不同Na2SeO3浓度对富硒酵母制备的影响Figure 3 Effect of Na2SeO3concentration on the preparation of selenium－enriched yeast

2.4 搅拌转速对高性能富硒酵母制备的影响

发酵罐转速影响到罐内的溶氧，研究了不同搅拌转速对细胞生长和代谢情况的影响，27℃下培养30h，其中在18h添加20mg／L Na2SeO3，结果见图4。由图4可知，随着发酵罐转速的增大，罐内溶氧浓度增大，细胞生物量、胞内GSH含量和有机硒含量也随之增加，细胞干重和有机硒含量在450r／min时达到最大值。当转速大于450r／min时，细胞干重和胞内有机硒含量没有明显增加。因此，确定发酵罐的搅拌转速为450r／min。

图4 搅拌转速对富硒酵母制备的影响Figure 4 Effect of agitation rate on the preparation of selenium－enriched yeast

2.5 L－蛋氨酸添加浓度对富硒酵母制备的性能

蛋氨酸是S－腺苷甲硫氨酸（SAM）的直接底物，SAM在一定条件下可转变为胱氨酸和半胱氨酸，而半胱氨酸则是促进GSH合成的关键性底物［12］。前期研究［11］发现，在分批培养时添加L－蛋氨酸可以促进富硒产朊假丝酵母的生长，同时也可以提高胞内GSH含量和硒的有机转化率。因此，在发酵开始时（0h）添加不同浓度的L－蛋氨酸，同时在18h添加20mg／L的Na2SeO3进行富硒酵母的制备，27℃、450r／min下培养30h，结果见图5。当L－蛋氨酸的添加浓度为10mmol／L时，细胞生物量、胞内GSH和有机硒含量均达到最大值，分别为11.32g／L，11.5mg／g和1 352μg／g。

图5 蛋氨酸的添加对富硒酵母制备的影响Figure 5 Effect of methionine addition on the preparation of selenium－enriched yeast

3 讨论

在富硒产朊假丝酵母的制备过程中，高浓度的Na2SeO3会影响生长期酵母细胞的正常生长和代谢［7］，所以合适的Na2SeO3添加时间对于提高富硒酵母的性能十分必要。本试验研究结果显示生长期的酵母细胞对硒的富集能力（胞内有机硒含量）差别不大，因此，为了不影响酵母细胞的正常生长，Na2SeO3最好在细胞生长结束时（18h）进行添加。

与前人研究［9－10］相比，虽然本试验制备的富硒产朊假丝酵母在胞内有机硒含量上尚有差距，但该种酵母的显著特点在于细胞内含有有机硒的同时还含有丰富的GSH。然而，酵母胞内GSH含量在富集硒的过程中有所下降，原因主要有：①Na2SeO3的添加会导致部分胞内GSH分泌到胞外［13］；② 胞内硒的积累将会提高谷胱甘肽过氧化物酶的活性，而谷胱甘肽过氧化物酶在作用时需要消耗直接底物GSH［3］。为此，在前期研究［7，11］的基础上，本试验通过合适的溶氧控制以及蛋氨酸的添加实现了胞内的GSH含量的保持和提高。

本试验以富硒产朊假丝酵母的高性能（高GSH含量和高有机硒含量）为目标，在发酵罐水平上通过对影响产朊假丝酵母富硒能力的因素进行研究，获得了较优的富硒酵母培养条件，即在发酵培养的第18小时加入20mg／L亚硒酸钠，发酵罐转速450r／min，L－蛋氨酸的添加浓度10mmol／L。在此条件下，酵母细胞干重为11.32g／L，胞内GSH和有机硒含量分别达到11.5mg／g和1 352μg／g，研究结果为高性能富硒产朊假丝酵母的高效制备奠定基础。由于该种富硒产朊假丝酵母同时具有较强的GSH合成能力和较高的有机硒含量，因此必将具有更为广阔的应用前景。

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Study on conditions for selenium enrichment improving ofCan dida utilis

WANG Da－hui YANG Bo WEI Gong－yuan DING Zhi－juan

（School of Biology and Basic Medical Sciences，Soochow University，Suzhou，Jiangsu215123，China）

Studied the effects of different culture conditions on cell growth of selenium－enrichedCandida utilis，the ability of glutathione biosynthesis and selenium enrichment cultured in a 5Lstirred fermentor.An optimum combination of culture conditions which involved 20mg／L sodium selenite added to the culture medium at 18h，together with agitation rate of 450r／min and 10mmol／L L－methionine added at 10h，were achieved under batch fermentation withC.utilisSZU 07－01.Under these optimal conditions，the dry cell weight was 11.32g／L，and the contents of intracellular glutathione and organic selenium were 11.5mg／g，1 352μg／g，respectively.This study laid a foundation for the efficient preparation of high quality（high intracellular glutathione and high organic selenium content）selenium－enrichedCandida utilis.

Candida utilis；organic selenium；glutathione

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.06.065

江苏省属高校自然科学研究项目（编号：09KJB530009）

王大慧（1975－），女，苏州大学讲师，硕士。E－mail：wdahui＠163.com

卫功元

2011－08－01