珠子参DNA的不同提取方法的研究

杨燊

摘要：目的：探讨适合SSR标记的DNA不同提取方法。方法：用经典CATB法,改良CATB法， SDS法，高盐低PH法，提取新鲜珠子参根部中总DNA，并对DNA进行电泳得出最佳提取方法。结论：最佳提取方法为改良CATB法。

关键词：珠子参； DNA提取；SSR分析； CATB法；SDS法；高盐低PH法

Beads and DNA from different methods

YangShen

(Yuxi teachers college, Resources and environment college, Biological science)

Abstract: objective: to study the different extraction methods of the SSR markers for the DNA. Methods: using classical CATB method, advanced CATB method, SDS method, high salt low PH method, fresh and root extract beads of total DNA, and through electrophoresis obtains the best extraction method. Conclusion: the best extraction method for improvement CATB method.

Keywords: beads; DNA extracted; SSR analysis; CATB method; SDS method; High salt low PH method

珠子参(PanacisMajirisRhizama)属于五加科、串珠状根茎植物，别称钮子七、珠儿参、扣子七。分布于我国的四川、陕西、云南等省。具有活络、止血的功效 [1-2]。现代药理学研究显示, 珠子参具有较广泛的药理作用, 对心血管系统、血液及造血系统、免疫系统、肿瘤等均有作用[2]。因此珠子参具有极高的研究价值，所以本实验用珠子参作为材料进行实验。珠子参根部次生代谢产物较多，其中酚类多糖类物质会影响珠子参总DNA的提取及SRR分析。本实验主要为了选取适合SSR分析的DNA不同提取方法的最佳方法，以便更加有效地提取珠子参总DNA。

1材料与实验方法及操作

1.1材料

1.1.1实验材料

实验材料取自大理市鹤庆县草海镇马厂的珠子参。该实验需要用到不同的提取方法及不同的保存方法，所以将各类方法和保存方法做如下标记：A、经典CTAB法 ，B、改良CTAB，C、SDS法，D、高盐低PH值法。

1.1.2仪器

离心机，水浴锅，冰箱，电泳仪，移液枪，RCP扩增仪，凝胶成像仪

1.1.3试剂

CTAB提取缓冲液：(10.00gCTAB，50.0mL 1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，

20.0mL 0.5mol/L EDTA，41.00g NaCl，定容至500mL）；

3%SDS提取缓冲液：(0.1mol/L Tris-HCl（pH8.0），0.05mol/L EDTA-Na2

， SDS，定容至250mL)；

去多糖Buffer：(100ml Tris-HCl(1mol/L)，50ml EDTA(0.5mol/L），NaCl7.305g，定容至500ml)；

高盐低PH值提取缓冲液：(0.1mol/L、pH=4.8 NaAc,0.05mol/L、pH8.0 EDTA-Na2，0.5mol/L NaCl，2%PVP，2%SDS，pH=5.5)；

TE：(5ml 1mol/L Tris-HCl，1ml 0.5mol EDTA, 定容至500ml)；

3%琼脂糖凝胶：(0.6g琼脂糖,20ml 1%TBE缓冲液)；

10X的TBE：（Tris碱108.00g，EDTA7.44g，硼酸55g,定容至1000ml）；

40%的聚丙烯酰胺凝胶：（双丙烯酰胺2.00g，丙烯酰胺38.00g，定容至100ml）；

6%的聚丙烯酰胺凝胶：（10xTBE 12ml，40%聚丙烯酰胺凝胶18ml，90ml H2O）；

银染所需试剂：（0.1%AgNO3溶液，3%Na2CO3溶液,10%HAc溶液,1%Na2S2O3溶液）；

0.5mol/L EDTA，β-巯基乙醇，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，Tris饱和酚，氯仿/异戊醇(V/V=24:1)，异丙醇，75%乙醇，琼脂糖，无水乙醇，5mol/L KAc，1X的TBE，TEMED，APS，硝酸，二甲苯氰，溴酚蓝

1.2实验方法及操作

1.2.1 经典CATB法[3] (有改动)

(1)取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中加入1200μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液混匀；(2)迅速将1.5ml离心管置于65℃水浴中，保温60min,每隔15min温和颠倒混匀； (3)待冷至室温后，取出1.5ml离心管，取上清液于另一离心管，每管加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，混匀后至溶液呈乳浊状，10000r/min离心10min；(4)小心将上清液相转移至另一个1.5ml离心管中，标号A1，A2，A3，在上清液中加入600μl预冷-20℃的异丙醇，轻轻混匀，至有白色絮状沉淀出现，-20℃静置保存1小时。(5)离心管从冰箱取出后10000r/min离心10min弃上清液，沉淀DNA；(6)用400μl 75%的乙醇洗2次， 7000r/min离心3min弃上清液；(7)然后再用400μl 无水乙醇洗，7000r/min离心3min弃上清液，然后置于空气中干燥；(8)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。

1.2.2改良CATB法[3-4] (有改动)

(1) 取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中加入少许石英砂和PVP，加入1.2ml的Buffer去多糖和24μlβ-巯基乙醇充分研磨成粉末，迅速将研磨好的珠子参粉末装入1.5ml离心管中；(2)10000r/min离心10min 弃上清液；(3)向3个1.5ml离心管中加入600μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液同时加入24μlβ-巯基乙醇，用毛细玻璃管搅拌充分；(4)迅速将1.5ml离心管置于65℃水浴中保温60min，每隔15min温和颠倒混匀；(5)待冷至室温后，取出1.5ml离心管，每管加入240μlKAc，放入冰箱-20℃60min；然后10000r/min离心10min (6)小心將上清液相转移至一干净的1.5ml离心管中，同时加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，放入垂直振荡器中充分混匀10分钟，然后10000r/min离心10min；(7)取上清液且分别标号B1，B2，B3干净的1.5ml离心管中，然后加入640μl -20冰浴的异丙醇，放入-20℃冰箱冷冻60min；(8)取出后在10000r/min离心10min沉淀DNA，弃上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min离心3min弃上清液；然后再用400μl无水乙醇清洗，洗后7000r/min离心3min，弃上清液，沉淀放置空气中干燥过夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。

1.2.3SDS法[5-6] (有改动)

(1) 取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中加入1200μl SDS提取缓冲液，并加入240μlβ-巯基乙醇充分研磨成粉末，迅速将研磨好的珠子参粉末装入1.5ml离心管中；(2)65℃水浴保温60min，每15min轻摇一次；(3)待冷却后加入230μl 5mol/L KAc,混合后冰浴60min；(5)取出后10000r/min离心10min，将上清液转移至另一1.5ml离心管中，每管加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)溶液，然后放入垂直振荡器中充分混匀10分钟；(4)取出后10000r/min离心10min；(5) 取上清液于分别标号C1，C2，C3干净的1.5ml离心管中，每管加入600μl预冷的异丙醇溶液混匀，放入-20℃冰箱冷冻60min；(6)取出后在10000r/min离心10min沉淀DNA；(7)弃上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min离心3min弃上清液；(8)然后再用400μl无水乙醇清洗，洗后7000r/min离心3min，弃上清液，沉淀放置空气中干燥过夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。

1.2.4高盐低PH值法[7-8] （有改动）

(1) 取3份新鲜珠子参每份0.5g分别放入3个研磨中分别加入1200μl 高盐低PH值提取缓冲液，充分研磨成粉末，迅速将研磨好的珠子参粉末装入1.5ml离心管中；(2)65℃水浴保温60min，每15min轻摇一次； (3)取出后10000r/min离心10min，将上清液转移至另一1.5ml离心管中，每管加入600μl KAc溶液，然后混匀，放入-20℃冰箱冷冻60min ；(4)取出后10000r/min离心10min；(5) 取上清液于分别标号D1，D2，D3干净的1.5ml离心管中，每管加入600μl预冷的异丙醇溶液混匀，放入-20℃冰箱冷冻60min；(6)取出后在10000r/min离心10min沉淀DNA；(7)弃上清液用75%的乙醇洗2次，7000r/min离心3min弃上清液；(8)然后再用400μl无水乙醇清洗，洗后7000r/min离心3min，弃上清液，沉淀放置空气中干燥过夜；(9)沉淀干燥后溶于加有100μl的TE溶解，待溶解后放入冰箱保存备用。

1.3 PCR扩增[9] （有改动）

将4种提取方法所提取的总DNA于NYC TECHNIK INC生产的ATC201 PCR扩增仪用SSR分析[10]进行扩增。反应体积25μl，引物：5-TAGTAGCGACGATCACCACG-3。 PCR扩增反应体系如下（1μl Tap酶,1μl dNTP(10mM),5μl 10Xbuffer(Mg2+ 20mM),1μl primerF, 1μl primerR, 1μl DNA模板（约50ng）,15μl H2O）。PCR扩增体系如下（94℃5min,(94℃45s,53℃1min,72℃1min30s进行36次循环)，72℃7min, 4℃保存）。

1.4琼脂糖凝胶电泳

用3%的琼脂糖凝胶对4种提取总DNA进行电泳。然后用凝胶成像仪拍照。

1.5聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染[11-12]（有改动）

先用6%的聚丙烯酰胺凝胶与促凝剂TEMED和APS混合制作胶版，然后用PCR扩增出来的样品与溴酚蓝混合后进行点样，250V电泳150min。取出板后進行银染，过程如下（先用25%的酒精溶液漂洗3min，再水洗1min；1.6%硝酸溶液硝化至二甲苯氰褪色，即蓝色条带变绿；1L 0.1%的AgNO3染色30min，水洗3min；1L 3%Na2CO3+2ml甲醛+200μl 1%Na2S2O3显色5-10min，直到显色满意为止；停显后照相保存相片，收拾清洗。

2结果与分析

2.1琼脂糖凝胶电泳检测结果及分析

图14种提取方法总DNA琼脂糖凝胶电泳图

从此图1中可以明显看到4种方法都能提取得到总DNA。但是A、C、D总体来看都有电泳拖尾（说明有DNA在电泳过程中分解），只有B的拖尾是最少的甚至无拖尾。

2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果及分析

图24种提取方法PCR产物聚丙烯酰胺电泳图

从图2中可以看到4种方法都能满足SSR技术的PCR扩增。

2.4实验分析

通过对上述实验结果进行综合分析得到方法B：改良CTAB提取法为珠子参根部DNA提取的最佳方法。因此对不同保存方法的珠子参根部DNA的提取采用方法B：改良CTAB提取法。

3讨论

通过实验发现：4种提取方法都能提取出满足SSR分析的要求，相比之下改良的CTAB法更好。因为改良CTAB法具有以下几个优点：（1）使用了石英砂，石英砂能使植物研磨更充分使细胞核破裂利于DNA提取；（2）使用了PVP，在实验过程中，珠子参中的许多酶被激活，因此产生了许多次级代谢产物如酚类、醌类等。PVP是一种酚的络合物，可以和酚类物质结合，能减少酚类的氧化从而减少酚类的含量[4-13]；（3）使用了β-巯基乙醇，它是一种强还原剂，可以减少多酚类物质及醌类物质对DNA的破坏作用[4-13]；（4）使用了去多糖buffer，在珠子参内含有大量的多糖类物质，在进行DNA提取的过程中会有大量的多糖类物质与DNA一同被析出，从而使提取的DNA不够纯净。去多糖buffer能有效的除去大量的多糖类物质；（5）使用了醋酸钾，KAc能使DNA聚合物能更充分的沉淀，提高产率。

参考文献

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注：文章内所有公式及图表请以PDF形式查看。