大豆幼苗根系抗氧化酶活性的耐酸、铝研究＊

刘 鹏， 俞慧娜， 吴玉环， 徐根娣， 郑艳萍， 周 菁

(1．浙江师范大学植物学实验室，浙江金华 321004;2．杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江杭州330036)

在我国，酸性土壤为红壤，且面积较大．近年来，随着酸雨的频繁发生以及农业生产中生理酸性肥料的大量施用，使得土壤的酸化进一步加剧，土壤的富铝化作用加强，铝毒害成为酸性土壤或酸化土壤上作物生长最重要的限制因素［1］．土壤pH的变化对植物生长影响的研究报道不多［2-3］．因此，了解酸、铝对植物的毒害对研究植物的耐铝性具有重要的理论和实践意义．铝的溶解性在很大程度上取决于土壤pH，因此，维持植物根际周围高pH值就能降低铝的溶解性，从而减轻铝毒害．有研究［4-6］指出，在相同pH下，改变溶液的铝浓度可以使植物根系生长受到更明显的抑制，根系活力和根系质膜透性也相应地受到影响．

大豆是我国的重要经济作物，研究其生产中对铝胁迫的防治具有重要的经济意义．目前有关金属离子胁迫对大豆抗氧化酶影响的研究报道比较多见，如:俞慧娜等［7］研究表明，一定浓度的锰可以提高大豆体内活性氧的清除和抗逆能力;郑世英等［8］通过实验发现，在低浓度的Cd2+胁迫下，野生大豆与栽培大豆幼苗叶片的3种抗氧化酶:过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)均高于对照组;徐心诚［9］的研究说明高浓度铅降低了大豆幼苗中SOD的活性，对大豆的生长有抑制作用;王启明［10］则对铬胁迫下大豆抗氧化酶活性的变化进行了探究．

关于铝对作物抗氧化酶活性影响的研究已开展了不少的工作，如对茶树［11］、小麦［12］、荠菜［13］，以及部分野生草本植物等都已有相关报道［14］．而通过不同酸、铝处理的探究工作较少见．李朝苏等［15］通过测试与铝胁迫直接有关的5个生理指标，研究了荞麦对酸、铝胁迫的生理响应;朱佳等［16］进一步报道了酸、铝处理对荞麦根系形态和体内抗氧化酶的影响．Boscolo等［17］通过对玉米不同酸、铝处理，探究了玉米叶片中 POD，CAT和SOD活性的变化情况．以大豆为研究对象，目前的研究工作主要集中在不同浓度的铝处理条件下的探究，如刘鹏等［18］报道了不同浓度铝处理对大豆幼苗膜脂过氧化和体内保护系统的影响．而关于不同酸、铝处理下大豆根系抗氧化酶系统活性变化的相关研究报道较少．本文采用水培实验法，以2个大豆品种(浙春2号和029-289)为材料，通过不同浓度酸、铝处理，研究了大豆根系的抗氧化物酶活性的变化，旨在为大豆的耐酸、铝机理深入研究提供资料．

1 材料和方法

1．1 材料与处理

以铝耐性品种浙春2号和敏感性品种029-289为材料进行水培实验．选大小一致、健康饱满的种子放入消毒过的砂土中萌发，当幼苗长至第1片真叶完全展开时，将其移入30 L的塑料箱中用1/2 Hoagland营养液培养，培养过程中每5 d更换1次营养液，用气泵每天2次通气，每次2 h．在营养液中培养到3小叶完全展开后，挑选根系长势基本一致的大豆幼苗，移入0．5 mmol·L-1CaCl2溶液中适应(又称洗根)12 h(黑暗条件下)，设置不同量的酸、铝 (T1:0 mmol· L-1Al+pH 3;T2:0 mmol·L-1Al+pH 4;T3:0 mmol·L-1Al+pH 5;T4:0．5 mmol·L-1(13．5 mg·L-1)Al+pH 5;T5:1 mmol·L-1(27mg· L-1)Al+pH 5;T6:1 mmol·L-1Al+pH 3)处理2，4，6，12 和24 h 后，对各项指标进行测定，用0．1 mol·L-1HCl溶液和0．1 mol·L-1NaOH溶液每2 h调节1次pH值．

1．2 测定方法

蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法［19］，用mg·g-1表示;SOD活性采用氮蓝四唑光化学还原法(NBT)测定［19］，用 U·mg-1表示;POD 活性采用愈创木酚法［19］，以每 min内 A470变化0．01为1个酶活性单位;CAT活性的测定采用硫代硫酸钠滴定法［19］，以1 min酶解1 mg H2O2为1个活力单位，用U·mg-1表示．每个处理重复3次．

2 结果与分析

2．1 酸、铝对大豆根系可溶性蛋白质含量的影响

由图1可知:随着酸、铝处理时间的增加，大豆根系可溶性蛋白质含量总体上呈现先增多后减少的趋势，在6 h时达到最大值，之后逐渐减少，在24 h时达到最小值;无铝(T1～T3)影响下，随着pH值的升高，可溶性蛋白质含量先增多后减少，在T2处理下达到最大值，说明适当提高pH值可以增加大豆根系的可溶性蛋白质含量;在pH 5条件下，随着Al3+浓度的增加(T3～T5)，大豆根系的可溶性蛋白质含量仍然先增加后减小，在0．5 mmol·L-1Al处理下达到最大;T6处理下大豆根系可溶性蛋白质含量达到各酸、铝处理下的最小值．

图1 酸、铝处理对浙春2号和029-289大豆根系可溶性蛋白质含量的影响

2．2 酸、铝对大豆根系SOD活性的影响

超氧化物歧化酶(SOD)的主要功能是催化超氧化物阴离子自由基O·-2发生歧化反应生成H2O2和O2，从而清除O·-2．因此，SOD活性是衡量植物受逆境胁迫大小的一个生理指标．由图2可以发现:随着处理时间的增加，大豆根系的SOD活性呈先上升后下降的变化趋势，在6 h时达到最大值，之后又逐渐下降，在24 h时达到最小值;在无铝(T1～T3)影响下，随着pH值的升高，SOD活性先升高后降低，在T2处理下达到最大值;在pH 5条件下，随着Al3+浓度的增加(T3～T5)，大豆根系的SOD活性发生变化，在T4处理下出现最大值，随后逐渐下降;T6处理下大豆根系SOD活性达到各酸、铝处理下的最小值，说明对大豆根系的伤害达到最大．

图2 酸、铝处理对浙春2号和029-289大豆根系超氧化物歧化酶活性的影响

2．3 酸、铝对大豆根系POD活性的影响

由图3可知:随着酸、铝处理时间的增加，大豆根系的过氧化物酶(POD)活性先上升后下降，在6 h时达到最大值，之后又逐渐下降，在24 h时达到最小值;在无铝(T1～T3)影响下，随着pH值的升高，POD活性先升高后降低，在T2处理下达到最大值;在pH 5条件下，随着Al3+浓度的增加(T3～T5)，POD活性逐渐增加(029-289在6 h时除外);T6处理下大豆根系POD活性达到酸、铝处理下的最小值，说明对大豆根系的伤害最大．

图3 酸、铝处理对浙春2号和029-289大豆根系过氧化物酶活性的影响

2．4 酸、铝对大豆根系CAT活性的影响

过氧化氢酶(CAT)活性的变化与POD活性的变化大体相似．由图4可以发现:随着处理时间的增加，CAT活性呈现先上升后下降的变化趋势，都在6 h时达到最大值，之后又逐渐下降，在24 h时达到最小值;在无铝(T1～T3)影响下，随着pH值的升高，CAT活性先升高后降低，在T2处理下达到最大值;在pH 5条件下，随着Al3+浓度的增加(T3～T5)，大豆根系的CAT活性逐渐增加(029-289在4 h时和浙春2号在4 h和6 h时除外)．T6处理下大豆根系的CAT活性达到各酸、铝处理下的最小值，说明对大豆根系的伤害达到最大，对植物的生长造成胁迫．

图4 酸、铝处理对浙春2号和029-289大豆根系过氧化氢酶活性的影响

3 讨论

铝是土壤中含量最多的金属元素，约占地壳总质量的8%．在近中性土壤中，铝不会对植物造成伤害，但在酸性环境中毒性较大的活性铝便会从土壤中析出，对植物造成危害．酸性土壤中作物产量的下降和森林的毁灭都和铝毒害有直接关系［20］．土壤中铝的形态受pH的影响，随着土壤的酸化，引起土壤中盐基离子的淋失，促进活性铝的释放．一般认为pH＜5．5时就有活性铝释出．在pH 4．0～ 5．5，铝 主 要 以 羟 基 铝 如 Al(OH)2+，Al(OH)2+的形式存在;在pH 4．0以下，铝主要以Al3+形式存在．铝毒害已经成为生长在酸性土壤中植物的主要限制因素［21］．因此，研究酸、铝对植物的作用具有实践意义．

铝对作物的毒害是通过根部将土壤溶液中的活性铝吸收到植物体内产生的．所以抑制根的生长是铝胁迫下植物出现的最早症状，这个症状对植物的影响以小时(h)变化，甚至在μmol/L铝浓度下以分(min)变化［22］．有研究表明，pH对大豆鲜质量的影响在pH 3．5 ～4．5抑制程度大，pH ＞4．5 时抑制程度小，随着pH下降，其根系生长受到抑制，虽未达到显著性差异水平，但还是对植物的生长造成了阻碍［6］．也有研究［23］认为，在 pH ＞4 时，H+对根的伤害可以忽略．

关于铝对植物根系的抑制时间问题一直以来都有不同的报道［20-21，24-28］，不同的作物对铝的反应时间有差异．本实验表明在酸、铝处理2 h后就可对大豆根系的抗氧化酶系统有作用．造成植物根系铝反应时间不同的原因，可能是由于植物铝耐性的不同导致植物对铝的敏感性不同，也有可能与铝的处理浓度有关．本实验中随着酸、铝处理时间的增加，大豆根系抗氧化酶活性和蛋白质含量都呈现先上升后下降的变化趋势，浙春2号和029-289两个品种都在6 h时达到最大值，之后又逐渐下降，在24 h时达到最小值．

铝对大豆抗氧化酶系统影响的研究大都停留在对植物叶片和单一铝作用下的研究，在酸性条件下对大豆根系的研究还未见报道．本研究中，随着pH由高到低，酸性逐渐增强，大豆根系蛋白质含量、抗氧化酶系统的活性都是先升高后下降，在T2处理时达到最高值．一定的酸处理能增加植物蛋白质含量，这可能是大豆对酸胁迫逆境的一种适应性表现．大豆根部的SOD活性诱导升高，以清除胁迫时植物体内的过量O2．-，这是植物的一种应激反应．随后SOD活性下降，表明该酶歧化O2．-的能力下降，导致组织中的O2．-积累．CAT是广泛分布于植物组织中的细胞内H2O2的重要清除剂．本研究中大豆根系的CAT活性在T1处理下低于T3，表明清除H2O2的能力下降，将造成H2O2积累［29］．细胞内H2O2不能及时清除，可与过量的O-2生成毒性更强的—OH．活性氧可直接攻击生物大分子，导致蛋白质、膜脂、DNA分子结构异常，使SOD和CAT等酶活性降低、细胞生理功能紊乱．POD对多种胁迫具有响应，能降解H2O2，参与植物细胞木质素合成、吲哚乙酸(IAA)降解［24，30］，在植物根组织中活性较高．本研究中，T2处理下大豆根系的POD活性有所增加，使组织清除H2O2的能力有所增强．

SOD对酸、铝胁迫的种间敏感性顺序为029-289＞浙春2号．POD和CAT的活性对Al胁迫均表现为先升后降，POD的种间敏感性顺序为浙春2号＞029-289;高浓度Al对CAT具有明显的抑制效应，CAT对Al胁迫的种间敏感性顺序为浙春2号＞029-289．在酸、铝长时间胁迫下，SOD对2种大豆体内活性氧的清除起到关键作用，可作为大豆抗铝能力强弱的敏感生理指标，2种大豆中浙春2号的抗铝能力最强，029-289次之．

在胁迫强度较轻、胁迫时间较短、胁迫速度缓慢时，SOD，CAT和POD的活性上升;在胁迫强度较大、胁迫时间较长、胁迫速度快时，SOD和CAT的活性下降．双重胁迫下，导致SOD活性始终呈现下降趋势，而CAT和POD的活性上升;CAT活性表现出双峰变化或前期上升、后期下降的趋势，此结果与卢少云等［31］的研究相同．

铝的溶解性在很大程度上取决于土壤pH，因此，维持植物根际周围高pH就能降低铝的溶解性，从而减轻铝毒害．本实验在pH 5条件下研究了不同浓度铝对大豆抗氧化酶活性的影响．可以看出，酸、铝对大豆根系抗氧化酶活性的影响不同:随着铝浓度的升高，蛋白质含量和SOD活性先升高后下降，在T4处理下达到最大值，而POD和CAT活性则逐渐升高．表明大豆根系可以在铝胁迫下通过POD活性升高与其他抗氧化酶一起来清除体内产生的活性氧，以减轻Al对植物的伤害．POD和CAT作为植物体内H2O2的清除剂［32］，随着酸、铝处理时间的增加，POD和CAT的活性随着铝浓度的变化逐渐上升，表明在酸、铝处理下大豆根系对H2O2的清除效果较好．把T1和T6处理相比，可以看出，相同pH条件下改变铝浓度，可以使大豆根系抗氧化酶系统受到更明显的抑制，总蛋白质含量也相应地受到影响，2个大豆品种都受到了最大的伤害．细胞受到氧化胁迫，由此引起的氧化损伤能够使植物的生理代谢紊乱、生长发育异常．

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