HE4、NF-κBp65和 MMP-9在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其临床意义

郭冰沁 俞 岚 武世伍 宋文庆 承泽农

HE4、NF-κBp65和 MMP-9在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其临床意义

郭冰沁 俞 岚 武世伍 宋文庆 承泽农

（蚌埠医学院第一附属医院病理科，蚌埠医学院病理学教研室，安徽省感染与免疫重点实验室，蚌埠233030）

目的 探讨HE4、NF-κBp65以及MMP-9的表达与上皮性卵巢肿瘤临床病理生物学行为的关系以及对患者预后的影响。方法 应用免疫组化对80例卵巢上皮性癌、10例交界性上皮性肿瘤及10例良性上皮性肿瘤组织进行HE4、NF-κB p65及MMP-9蛋白的检测。结果 HE4、NF-κBp65及MMP-9蛋白的阳性表达率在卵巢癌组均高于交界性及良性肿瘤组（P＜0.05）。三个指标的表达与EOC的组织学分级、腹腔脏器及淋巴结转移以及PTNM临床分期有关（P＜0.05）；在EOC中，NF-κBp65分别与 HE4、MMP-9的表达呈正相关（r1＝0.673，P＜0.05；r2＝0.775，P＜0.05）。多因素分析，PTNM 分期、MMP-9的表达是影响卵巢癌术后患者预后的独立因素（P＜0.05）；HE4阳性组与阴性组5年生存率分别为12.7%和84.0%，MMP-9阳性组与阴性组5年生存率分别为8.7%和70.6%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 NF-κBp65可能通过上调HE4、MMP-9的表达促进EOC的浸润和转移，联合检测HE4、NF-κBp65以及MMP-9的表达可能作为预测和评价患者预后的生物学指标。

卵巢上皮性癌；人附睾蛋白4；核转录因子-κB；基质金属蛋白酶-9；免疫组织化学；预后

卵巢癌是全球妇科恶性肿瘤中病死率最高的一种。临床上由于缺乏有效的筛选方法，70%的患者就诊时已属晚期，5年生存率仅30%左右，并且常出现复发和转移。因此，寻找特异性的肿瘤标志物一直是卵巢癌研究的热点问题。本研究通过对80例上皮性卵巢癌（Epithelial Ovarian cancer，EOC）、10例卵巢交界性上皮性肿瘤以及10例良性上皮性肿瘤组织 HE4、NF-κBp65以及 MMP-9的表达水平进行检测，以探讨它们的表达与卵巢癌侵袭、转移以及预后的关系。

材料和方法

1.一般资料

选择蚌埠医学院第一附属医院病理科2000年1月-2002年12月存档蜡块EOC组织标本80例（术前未行放、化疗），所有病例均有完整的临床、病理及随访资料，入选病例随访至患者死亡或截止2010年11月，随访时间为7-96个月。根据UICC2002版PTNM病理分期标准进行分期，早期（FIGOⅠ、Ⅱ期）卵巢癌43例，晚期（FIGO Ⅲ、Ⅳ期）卵巢癌37例；浆液性癌63例，黏液性癌10例，子宫内膜样癌7例；有腹腔脏器及淋巴结转移者38例，有腹水者21例。年龄19-76岁，中位年龄52.0岁，≥50岁36例，＜50岁44例；肿瘤平均最大直径6.2cm，≥6.0cm 48例，＜6.0cm 32例。选择卵巢交界性上皮性肿瘤10例以及良性上皮性肿瘤10例作为对照组。复阅上述患者的病理切片，选取存档标本石蜡块进行切片，厚度4μm。

2.免疫组织化学染色

兔抗人HE4多克隆抗体，鼠抗人MMP-9单克隆抗体（克隆系15W2），二步法免疫组化检测试剂盒以及以及DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。鼠抗人NFκBp65单克隆抗体（克隆系sc-8008）购自Santa Cruz公司。将石蜡标本连续切片，烤干，于二甲苯溶液及不同浓度的乙醇中脱蜡至水洗。免疫组化染色操作步骤按试剂盒说明书进行。采用已知阳性片作对照，以PBS液代替一抗作空白对照。

3.结果判定

NF-κBp65以肿瘤细胞胞核内出现棕黄色颗粒的细胞数≥10%定为激活型表达。阳性瘤细胞表达数＜10%为阴性，≥10%为阳性。HE4及 MMP-9阳性染色均为肿瘤细胞胞质内出现棕黄色颗粒或团块。采取二次计分法：每例标本随机计数5个高倍视野（×400），计数每个高倍视野中阳性细胞所占百分比取其平均阳性率并计分。首先将染色强度计分：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。再按阳性细胞百分比计分，0分为阴性，1分为阳性细胞＜10%，2分为11% ～50%，3分为51% ～75%，4分为＞75%。用染色强度得分和阳性细胞数得分的乘积作为判断表达结果，若积分≤2为阴性，＞2为阳性。免疫组化结果由高年资病理医师读片评定。

4.统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。HE4和MMP-9表达阳性组与阴性组生存分析用Kaplan-Meier法，组间比较用log-rank检验，多因素分析采用Cox回归多因素模型，HE4、MMP-9和NF-κBp65在各种卵巢上皮性肿瘤中的表达情况以及三者在EOC中的表达与各临床病理因素的相关性均采 用 Fisher exact 法 检 验，NF-κBp65 与 HE4、MMP-9的表达相关性采用Spearman检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.HE4、MMP-9及NF-κBp65蛋白在EOC、交界性及良性上皮性卵巢肿瘤组织中的表达 卵巢浆液性癌、黏液性癌、子宫内膜样癌、卵巢交界性及良性上皮性肿瘤五个组间 HE4、MMP-9及 NF-κBp65阳性表达率差异均分别具有显著性（P＜0.05）。三个恶性肿瘤组分别与交界性组及良性组组间进行比较，HE4、MMP-9的阳性表达率在卵巢浆液性癌、交界性及良性上皮性肿瘤组间存在显著性差异（P＜0.05），同时，两者的表达在子宫内膜样癌组、交界性组及良性肿瘤组三个组间亦存在显著性差异（P＜0.05）（表1，图1-3）。

2.HE4、MMP-9及 NF-κBp65蛋白在 EOC中的表达与临床病理指标的关系 EOC中，HE4、MMP-9及NF-κBp65的表达与患者的年龄、肿瘤的组织学类型以及肿瘤大小差异均无统计学意义（P＞0.05），而与肿瘤的临床分期、组织学分级及腹腔器官、淋巴结转移有关。三者的表达在临床分期Ⅲ-Ⅳ期均高于Ⅰ-Ⅱ期（P＜0.05），高、中和低分化组HE4蛋白阳性表达率分别为35.3%、70.0%和84.8%，MMP-9蛋白阳性表达率分别为 5.9%、60.0%和81.8%，NF-κBp65蛋白阳性表达率分别为5.9%、60.0%和72.7%，其阳性表达率均随着肿瘤恶性级别的增高而显著增加（P＜0.05），有腹腔器官及淋巴结转移者均高于无转移者（P＜0.05）（表2）。

表1 卵巢EOC、交界性及良性上皮性肿瘤中HE4、MMP-9及NF-κBp65蛋白的表达Table 1 Expression of HE4，MMP-9and NF-κBp65in EOC，borderline and benign epithelial ovarian tumor

表2 80例EOC组织中HE4、MMP-9及NF-κBp65的表达与临床病理因素的关系Table 2 Correlation of HE4，MMP-9and NF-κB expression to clinicopathologic indexes of 80cases of EOC

3.EOC中 NF-κBp65与 HE4、MMP-9表达的关系 Spearman相关分析显示，在EOC中NF-κBp65分别与 HE4、MMP-9的表达呈正相关性（r1＝-0.775，P＜0.05；r2＝-0.673，P＜0.05）（表3）。

表3 EOC中NF-κBp65表达与HE4、MMP-9表达的关系Table 3 Correlation of NF-κBp65expression to HE4and MMP-9expression in EOC

图1 HE4蛋白在卵巢浆液性癌中的阳性表达（SP×400）；图2MMP-9蛋白在卵巢粘液癌中的阳性表达（SP×400）；图3NF-κBp65蛋白在卵巢子宫内膜样癌中的阳性表达（SP×400）Fig.1 Expression of HE4protein was observed in ovarian serous carcinoma（SP×400）；Fig.2 Expression of MMP-9protein was observed in ovarian mucinous papillary carcinoma（SP×400）；Fig.3 Expression of NF-κBp65protein was observed in ovarian endometrioid carcinoma（SP×400）

4.多因素分析 将年龄（分为≤50岁组与＞50岁组）、组织学分型（浆液性癌、黏液性癌及子宫内膜样癌）、PTNM分期（分为Ⅰ-Ⅱ期组与Ⅲ-Ⅳ期组）、病理组织分化（分为高、中、低分化组）、肿瘤直径（分为≤6.0cm组与＞6.0cm组）、腹腔器官及淋巴结转移（分为有转移组与无转移组）、NF-κBp65表达（分为阳性组与阴性组）、HE4表达（分为阳性组与阴性组）和 MMP-9表达（分为阳性组与阴性组）等因素引入Cox模型进行多因素分析，结果显示：MMP-9的表达及PTNM分期是影响EOC术后患者预后的独立因素（表4）。

表4 80例卵巢癌患者多因素分析Table 4 Multivariate survival analysis of 80patients with EOC

5.生存分析

本组病例总的5年生存率为35.0%。Kaplan-Meier生存分析显示HE4阳性组与阴性组5年生存率分别为12.7%和84.0%，差异有统计学意义（P＜0.05）；MMP-9阳性组与阴性组5年生存率分别为8.7%和70.6%，差异有统计学意义（P＜0.05），生存曲线见图4和图5。

图4 HE4表达阳性组与阴性组EOC患者生存曲线；图5 MMP-9表达阳性组与阴性组EOC患者生存曲线Fig.4 Survival curves of EOC patients with positive or negativeHE4expression；Fig.5 Survival curves of EOC patients with positive or negative MMP-9expression

讨 论

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类与肿瘤的侵袭和转移关系十分密切的蛋白水解酶家族成员，通过降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）和 基 底 膜 （basement membrane，BM），促进恶性肿瘤的血管形成以及侵袭和转移。MMP-9是MMPs家族中的重要一员，又名Ⅳ型胶原酶或明胶酶，能降解细胞膜基质中的主要成分Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶，从而在肿瘤的恶性演变中发挥重要作用［1］。大量的研究证明，在乳腺癌［2］、卵巢癌［3］、胃肠癌、头颈鳞癌等许多肿瘤中MMP-9均有不同程度表达，并且其表达情况与这些恶性肿瘤的预后密切相关。

人附睾蛋白 4（human epididymis protein 4，HE4）是WFDC2基因的产物。1991年由Kirchhoff等［4］首先从人的附睾远端上皮细胞中克隆到HE4基因的cDNA，并进行了报道。HE4基因位于染色20q12～13.1上，由两个“乳清酸性蛋白（whey acidic proteins，WAP）域”和一个“4-二硫化中心”组成，属于 WAP基因家族成员，其家族成员还包括SLPI和 Elafin。1999年Schummer等［5］通过cDNA微阵列、反转录聚合酶链反应和Northerm印迹杂交等方法分析了不同来源的卵巢癌及癌旁组织中的HE4基因表达水平，发现其mRNA在卵巢癌组织中有较高表达，但在癌旁组织中却未见表达。最近研究发现［6］，HE4在肺癌、胰腺癌、移行细胞癌、胃肠癌、乳腺癌、卵巢癌等恶性肿瘤组织中高表达，并且发现在卵巢癌中表达增高的最明显。2005年Drapkin等［7］用免疫组织化学方法进一步描述了HE4在不同组织类型卵巢癌的表达，发现HE4在50%卵巢透明细胞癌、93%的卵巢浆液性癌及100%卵巢子宫内膜样癌表达，而在卵巢黏液性癌及正常卵巢组织中不表达。Lu等［8］研究结果显示，通过HE4检测可筛查出正常人群中100%的浆液性肿瘤、89%的子宫内膜肿瘤、43%的透明细胞瘤、22%的黏液性癌。提示该基因可能是一个卵巢癌相关基因，其启动子有可能应用于卵巢癌的靶向性基因治疗。卢仁泉等［9］应用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测116例EOC患者与对照者血清的HE4浓度水平，卵巢癌患者血清HE4水平随着肿瘤分级、分期的升高而升高，淋巴结转移患者HE4水平显著高于未转移者（U值为665.5，P均＜0.01）。张东妹等［10］研究结果表明，HE4可作为卵巢癌诊断的独立生物学指标。管桂峰［11］的研究表明，OPN通过促进HE4蛋白刺激基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子的产生，能够引起细胞外基质降解和肿瘤组织血管形成，从而增强肿瘤细胞的侵袭浸润能力，导致肿瘤转移发生。目前，国内关于HE4蛋白在卵巢癌组织中表达的研究还较少，相关研究大多还集中于血清学方面。

本实验通过免疫组化检测了卵巢良性、交界性以及各组恶性上皮性肿瘤中HE4、MMP-9蛋白的表达，结果表明卵巢浆液性癌、黏液性癌、子宫内膜样癌、卵巢交界性及良性上皮性肿瘤五个组间HE4及MMP-9阳性表达率差异均分别具有显著性（P＜0.05）。并且HE4、MMP-9的阳性表达率在卵巢浆液性癌、交界性及良性上皮性肿瘤组间以及在子宫内膜样癌、交界性及良性肿瘤组组间都存在显著性差异（P＜0.05）。进一步的分析发现，HE4、MMP-9阳性表达率均随着EOC的病理分级增高而显著增加（P＜0.05），临床分期愈晚表达愈高（P＜0.05），有腹腔器官及淋巴结转移者明显高于无转移者（P＜0.05）。这些结果与上述国内外文献报道基本一致。

核转录因子κB （nuclear factor-κB，NF-κB）是一个广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子，最先在成熟的B细胞中被发现，因其能够与B细胞免疫球蛋白上的κB轻链基因增强子κB序列特异结合而得名。Shishoodia等［12］研究表明，NF-κB通过调节许多与黏附及侵袭相关因子的转录过程而参与恶性肿瘤的侵袭和转移。乳腺癌、子宫颈鳞癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中都发现有 NF-κB的活化［13］。本实验显示，NF-κBp65蛋白表达阳性率在各组上皮性卵巢癌与卵巢交界性及良性上皮性肿瘤组比较，组间差异具有显著性 （P＜0.05），卵巢癌组表达阳性率较高。NF-κBp65阳性表达率均随着EOC的病理分级增高而显著增加（P＜0.05），临床分期愈晚表达愈高（P＜0.05），有腹腔器官及淋巴结转移者明显高于无转移者（P＜0.05）。当细胞受多种因素的刺激时，通过一系列细胞信号转导作用NF-κB被释放出来，在入核引导序列的作用下进入细胞核，启动下游靶基因的表达。目前有研究［14］认为，MMP-9的转录激活机制依赖于 NF-κB，活化的NF-κB与 MMP-9启动子上的κB序列结合，使MMP-9表达上调，进一步降解肿瘤基底膜和细胞外基质，促进肿瘤的侵袭和转移。我们的实验结果通过Spearman相关分析显示，在EOC中NF-κBp65与 MMP-9 的 表 达 呈 正 相 关 性 （r＝-0.673，P＜0.05），随着 NF-κBp65表达的增加，MMP-9也表达增加，这可能表明是NF-κB的活化上调了 MMP-9的表达。Adam［15］研究发现，WAP基因家族在卵巢癌中均有较高的表达，该基因家族也可以与NF-κB的基因位点结合促使其活化，从而表现出在卵巢癌细胞中的过表达，并与卵巢癌的预后不良有关。因此，HE4作为WAP基因家族的一员，在卵巢癌中高表达很可能是受到NF-κB诱导的结果。我们的实验结果显示，在EOC中NF-κBp65与HE4的表达也呈现正相关性（r＝-0.775，P＜0.05），这与 Adam的实验结果具有一致性。

本次实验数据进行多因素分析，结果显示MMP-9的表达和PTNM分期是影响EOC的独立预后因素。生存分析显示，HE4阳性组与阴性组5年生存率分别为12.7%和84.0%；MMP-9阳性组与阴性组5年生存率分别为8.7%和70.6%，两组间差异均有显著性（P＜0.05），这提示 HE4及MMP-9表达阳性的卵巢EOC患者术后生存时间更短，预后更差，HE4和MMP-9可能协同促进了卵巢癌的恶性进展。

本实验初步探讨了EOC组织中 HE4、NF-κBp65以及 MMP-9的表达与其侵袭、转移以及预后的关系。实验结果提示，联合检测 HE4、NF-κBp65和MMP-9蛋白的表达对早期筛选卵巢癌高危病例、判断其恶性程度及评估预后有重要意义。同时，HE4基因和MMP-9将有望成为控制卵巢癌细胞生长、侵袭以及治疗肿瘤的新靶点。

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［9］卢仁泉，郭林，沈烨红.HE4在卵巢癌诊治中的临床应用评价 .中国癌症杂志，2010，20（9）：680-685

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Expression of HE4，NF-κB p65，MMP-9and Their Clinical Significance in Epithelial Ovarian Noeplasm

Guo Bingqin，Yu Lan，Wu Shiwu，Song Wenqing，Cheng Zenong
（Department of Pathology，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical Collge；Anhui Key Laboratory of Infection and Immunology，Bengbu233030，China）

Objective To study the association of the expression of HE4，NF-κBp65and MMP-9with the clinicobiologic behavior and prognosis of epithelial ovarian neoplasm.Methods Immunohistochemical staining was used to detect the expression of HE4，NF-κBp65and MMP-9proteins in 80cases of EOC，10 cases of borderline epithelial tumors and 10cases of benign epithelial tumors.Results The positive expression of HE4，NF-κBp65and MMP-9proteins in EOC were higher than those in borderline and benign tumors of the ovary，and there were significant differences among the three（P＜0.05）.The 3indexes in EOC were significantly related to differentiation，abdominal organ and lymph node metastasis，and PTNM stage，respectively（P＜0.05）.There was a positive correlation between the expression of NF-κBp65and HE4（r1＝-0.673，P＜0.05），MMP-9（r2＝-0.775，P＜0.05）.PTNM stage and MMP-9expression were independent prognosis factors of EOC （P＜0.05）.The 5-year survival rate was significantly different between the HE4-positive and HE4-negative groups（12.7%vs 84.0%，P＜0.05），and between the MMP-9-positive group and the MMP-9-negative group （8.7%vs 70.6%，P＜0.05）.Conclusion Through upregulationing the expression of HE4and MMP-9，NF-κBp65may promote invasion and metastasis of EOC.Thus detecting HE4，NF-κBp65and MMP-9can be used as markers to predict the prognosis of EOC patients.

EOC；Human epididymis protein 4；Nuclear factor-κB；Matrix metalloproteinase-9；Immunohistochemistry；Prognosis

R737.3

A

10.3870／zgzzhx.2011.06.008

2011-06-21

2011-07-14

安徽省科技厅研究项目（09020304050）

郭冰沁，男（1972年），汉族，讲师。