PCR技术在呼吸道病毒检测中的应用进展

石 晶（综述），孔晓慧（审校）

（首都医科大学附属北京儿童医院儿科研究所免疫室，北京 100045）

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）自从问世以来，经过几十年的发展，其在各项领域中的作用已愈显重要，特别是在各种病毒的快速准确检测中，更是以往的传统检测方法所不能比拟的。PCR的基本过程类似于DNA的天然复制，特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。整个过程由变性-退火-延伸3个基本反应步骤构成。通常，每完成一个循环需时2～4 min，2～3 h就能将靶核苷酸扩增放大几百万倍［1］。目前的PCR技术已有十几种，每种都有其优缺点，下面对各种PCR技术在病毒检测中的应用作简要综述。

1 反转录聚合酶链反应（reverse transcript PCR，RT-PCR）

RT-PCR是提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的敏感度提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。采用敏感性较高的RT-PCR方法，总的病毒检出率提高，且检测的病毒种类比较多，对目前报道的可引起儿童呼吸道感染的9种常见病毒病原包括新发现的人类博卡病毒均能进行检测［2］。

2 PCR-免疫

在常规的分子生物学中，对PCR扩增的产物的分析主要是采用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴化乙锭染色，在紫外灯下观察、拍照。这种方法简单经济，但是其缺点是存在假阴性、假阳性，溴化乙锭污染环境，紫外线伤害人体，只能进行定性或半定量分析，不能准确定量［3］。目前发展的 PCR-免疫，即用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法来检测并定量PCR产物已经解决了这个问题。PCR-免疫技术包括被测目的DNA的PCR扩增和PCR产物的检测两部分。它主要是用一对分别标记了生物素和捕获抗体固定扩增产物，用标记上碱性磷酸酶的抗地高辛抗体进行双抗夹心ELISA。与凝胶电泳、EB显色相比，ELISA方法检测定量PCR扩增产物结果具有更高的稳定性和可重复性。凝胶电泳、EB显色的变异系数（CV）达到38%，而ELISA的变异系数只有10%。而且，以荧光染料AttoPhos作为显色底物的ELISA检测敏感度比凝胶电泳、EB显色高10倍。另外，荧光强度和抗原检测量的相关系数也高达99%。这种PCRELISA更节省时间，且易于自动化操作和便于临床检测。它也为病毒的早期检测提供了一个可行的平台，因为它需要的样本量很小［4］。国际上免疫PCR技术近两年发展很快，主要用于检测体内激素、肿瘤、病毒、细菌、支原体、衣原体等［5］，它作为一种抗原检测系统，同时具有抗原抗体反应的特异性和PCR的高敏感性、适合于各种微量抗原的检测，并且可以直接检测细胞上的抗原。

3 实时荧光定量RT-PCR

所谓实时荧光定量RT-PCR技术，是指在反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时检测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的一种方法。在传统的PCR中，通常用凝胶电泳分离并用荧光染色来检测PCR反应的最终产物，因此用此终点法对PCR定量存在不足之处。在实时荧光定量RT-PCR中，对整个PCR反应扩增产物过程进行了实时的监测和连续的分析扩增相关的荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号变化可以汇成一条曲线，在PCR反应的早期，产生的荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和最后的平台期，因此可以在PCR反应处于指数期的某一点上来检测PCR产生的量，并且由此来推断模板最初的量。实时荧光的应用很广泛，包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定等，它是一种常规的能分析病毒核苷酸特性的检测方法［6］。张萍等［7］对617份流感病毒标本进行检测，其中实时荧光定量RT-PCR检测阳性152份，阳性率为24.64%;犬肾传代细胞细胞培养法分离流感病毒79株，阳性率为12.80%。两者的阳性率差异有统计学意义。因此，实时荧光定量RT-PCR和细胞培养方法检测流感病毒具有一致的特异性。实时荧光定量RT-PCR可作为一种快速有效的流感病毒核酸检测法，适用于公共卫生应急疫情的实验室快速诊断。胡晓武等［8］以甲型流感病毒特异M基因的保守区为靶区域设计特异引物和TaqMan荧光探针，建立一步法实时荧光定量RT-PCR方法，并对乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒Long株、冠状病毒OC43及229E、副流感病毒（1、2、3型）以及季节性流感病毒（H1、H3）进行检测，得出一步法实时荧光定量RT-PCR可对甲型流感病毒进行特异扩增，操作方便快速，对H1和H3亚型的最低检出限可达0.01 TCID 50/mL;对384例临床咽拭子样本的检测准确度达99.5%，一步法实时荧光RT-PCR方法可实现对甲型流感病毒快速准确的检测，有助于对临床流感病例的快速诊断。与其他检测技术相比，实时荧光定量PCR的敏感度分别是病毒分离培养的10倍，常规 RT-PCR的30～40倍。实时荧光PCR技术与其他分子生物学技术相结合使定量极微量的基因表达或DNA拷贝成为可能，但是与传统的PCR技术相比，实时荧光定量PCR也有不足之处:①由于运用了封闭的检测，减少了扩增后的电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小;②实时荧光PCR因为荧光种类及光源的局限性，相对地限制了多重检测得能力;③目前此项技术的成本较高［9］。

4 多重PCR

多重PCR（multiplex PCR，又称多重引物PCR或复合PCR），是在同一PCR反应体系里加入两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR技术已被广泛应用于核酸诊断的许多领域，包括基因剔除分析、突变和多态性分析、定量分析及RNA检测等。在感染性疾病领域，多重PCR技术已经显示出它的价值，成为识别病毒、细菌、真菌和寄生虫的有效方法。一次多重PCR反应可同时检测、鉴别出多种病原体，在临床混合感染的鉴别诊断上具有其独特的优势和很高的实用价值［10］。当前多重PCR在病原微生物的检测方面应用最为广泛。虽然多重PCR检测方法仅为定性检测，但其发展较为成熟，在保持了较高特异性和敏感度的同时，研制周期和成本明显低于实时荧光定量PCR和基因芯片，实验步骤简单，检测时间短，有利于在临床广泛应用。

5 多重PCR技术为基础的反式线点杂交（multiplex PCR-based reverse line blot hybridization，mPCR/RLB）

北京儿童医院［11］利用mPCR/RLB检测7种病毒株，均得到相应的目标扩增产物，扩增条带清晰，与目标片段一致。且7种病毒株:人流感病毒（A、B型）、人副流感病毒（1、2、3 型）、人腺病毒（Adv）、呼吸道合胞病毒（RSV）RLB杂交均得到清晰的杂交模式，并且彼此之间没有交叉反应。与作为阳性对照的细菌标准菌株亦没有交叉反应。RLB方法的敏感度比PCR高10～100倍，任何一种毒株间均没有交叉反应，7种病毒株同时与作为阳性对照的细菌标准菌株均没有交叉反应，显示了特异的杂交模式。延长免疫印记底物曝光时间至过夜，同样没有交叉反应。同一张膜重复进行实验，检测结果完全一致，杂交信号无减弱现象。mPCR/RLB是方便、客观的检测方法，它能同时从43个不同标本中检测到43个目标基因，它的灵活性要比DNA微阵列高，并且还便宜［12］。mPCR/RLB所需 DNA 量少，仪器简单，杂交膜可重复利用，每张膜可重复使用15～20次，大大降低了每份标本的检测费用。同一份标本可多次重复，杂交结果稳定，可重复性好。本法具备了简单、经济而且灵活等特点，适合混合感染和需要较高培养要求的病原体的检测［13］，一次检测标本数可多达43份，适合对临床标本进行高通量检测。

6 多重实时荧光RT-PCR

多重实时荧光RT-PCR的实质是指在一个反应管中加入针对多种基因的引物和不同标志物标记的探针（通常为可发出不同波长荧光的基团），以对多重目标基因同时进行扩增和检测。该方法在呼吸道疾病病原体的诊断中有广阔的应用前景［14］。多重实时PCR技术核酸扩增和检测在同一反应密封管中同时进行，具有敏感度高、特异性强、准确快速的特点，但是其引物和探针设计较为困难，并且需要具备多通道检测能力的实时荧光PCR仪。Chen等［15］用实时荧光技术在同一个检测管里检测新型HINI-2009病毒和季节性H3N2病毒、流感病毒B和呼吸道合胞病毒，其检测灵敏度和特异度分别为99%和100%。Hymas等［16］用三重实时荧光PCR检测流感病毒A、流感病毒B和呼吸道合胞病毒，与疾病控制中心的结果对比，流感病毒A的检出率是100%，此技术有99%的符合率。对流感病毒的检出限制在750～1500个拷贝之间，并且与其他呼吸道病之间没有交叉反应。多重实时荧光RT-PCR与病毒培养或免疫荧光相比有96.5%的特异性和98.0%的灵敏度［17］。当冬季流感病毒和呼吸道合胞病毒一起传播的时候，这种方法对病毒的同时检测很有用［18］。但是，该方法在临床诊断中最大的障碍是:如何能保证在同一反应体系中，针对每一病原体的PCR的特异性和敏感性都能达到临床的检测要求。

7 反转录为基础的电喷雾电离质谱技术（multi-locus RT-PCR followed by electrospray ionization mass spectrometry，RT-PCR/ESⅠ-MS）

RT-PCR/ESI-MS结合了反转录和质谱分析的优点，它是一种高通量的核酸依赖技术，能精确地测出PCR扩增产物的量。这种技术首先用于微生物的鉴定和确定分型，后来又应用于流感病毒的检测和鉴定［19］，它使呼吸道病毒的快速诊断成为可能［20］。检测呼吸道病毒的RT-PCR/ESI-MS能一次性检测出呼吸道合胞病毒，如流感病毒A、B，1～4型的副流感病毒、腺病毒、冠状病毒和人偏肺病毒等多种病毒。Chen等［21］通过对2007～2008年呼吸急诊室中的患者检测发现，RT-PCR/ESI-MS的灵敏度和特异度分别是89.1%和80.3%，在传统检测方法中不能被检测到的病毒也被检测到。此种技术的功能在呼吸道病毒的检测中是明确的。

8 环介导的反转录等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP是近年来发展出来的一种核酸扩增技术。通过设计识别目的片段6个序列的4个特异引物，整个反应可以在恒温（60～65℃）条件下1 h内完成，由于采用4个引物，与传统的核酸扩增技术相比，LAMP简化了94℃变性的步骤，同时退火和延伸在同一温度条件下进行，整个扩增反应历时短，一般为30～60 min即可判断结果。Le等［22］结合RNA的快速提取和RT-LAMP，9种目的病毒都能在2 h之内检测到，这种检测技术的敏感性比一步RT-PCR要高或与之相同，并且，有两种病毒不光在感染的病例中被检测到，在昆虫的携带者中也有检测到。它具有敏感、特异的特点;且产物中有大量的副产物——白色焦磷酸镁沉淀，扩增产物可通过肉眼观察或浊度计即可判定结果;反应不需要精密控温设备和高级复杂的分析仪器，对操作人员的熟练度和专业水平要求不高，因此该方法特别适合基层或者实验条件较差的试验室进行病原微生物的快速检测［23］。

9 扩增片段长度多态性分析（amplified fragment length polymorphism，AFLP）

AFLP技术是一项新的分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用两种酶切割产生，一种是罕见切割酶，另一种是常用切割酶。它结合了限制性片段长度多态性和PCR技术特点，具有限制性片段长度多态性技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可作为一种分子标记。AFLP具有可靠性好，重复性强，可信度高等优点。de Vries等［24］通过调整反转录酶和降低rRNA的复制优化了AFLP技术，使其明显地增强了反应的敏感性，也提供了一种可行的直接从患者的物体上检测到病毒的方法。

呼吸道病毒是一组能够通过呼吸道传播引起呼吸系统或及其他系统疾病的病原微生物。呼吸道病毒传染性强，可以引起局部暴发和世界大范围流行，严重影响人类健康。由于呼吸道致病微生物感染临床症状相似，影像学表现缺乏特异性，因此病原学证据在临床诊断和流行病监控中十分重要，由于传统病毒诊断技术存在明显缺陷，其在临床中的应用受限。随着分子生物学的进步，特别是PCR技术的发展为呼吸道病毒的鉴定与分型提供了新的选择。PCR反应中根据病毒保守序列设计引物，并可对微量模板（pg水平）进行指数级扩增，是简便、快速、敏感、特异性强的病毒检测方法。正如有人提到的，最初PCR的出现，并不是为了解决某一个特定的难题，PCR出现后，各种各样的需要PCR方法才能解决的问题，就不断出现。

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