M icroRNAs在眼部的表达及作用研究进展

田 蕊 苏冠方

MicroRNAs(miRNAs)是一类非编码的单链RNA分子,长度约 22个核苷酸,是目前已知的最大的基因家族之一。迄今为止,人类基因组中已鉴定出 600多个miRNAs,它们可能调节大量的蛋白编码RNAs (mRNAs),并且每一种mRNA可能被几种miRNAs同时调节[1]。近年,miRNAs重要的生物学性质和功能逐渐成为国际研究领域的新热点。相关研究认为:miRNAs在早期发育、增殖、分化、凋亡、信号转导等方面均具有重要的调节作用[2-3],miRNAs的异常表达可能导致疾病的发生,如癌症[2]、发育异常[4]、心血管异常[5]及炎症性疾病[6]等。关于miRNAs在眼科领域中作用的研究仍处于起步阶段,一些研究相继检测了其在生理状态眼组织中的表达和分布情况,而其在眼部疾病中的表达及作用也备受关注[7]。现就miRNAs的相关研究进行综述。

1 m iRNAs在眼部的表达

1.1 全眼组织m iRNAs表达 Lagos-Quintana等[8]首先从成年小鼠眼球中分离出7种miRNAs(miR-129b、-181、-182、-183、-184、-185、-186)。随后,Wienholds等[9]在斑马鱼全眼中证实了13种miRNAs (miR-182、-183、-96、-9、-213、-124、-30e、-5p、-181a/b、-204、-216、-217)的表达。Karali等[10]根据上述研究,在全组织标本包埋的小鼠胚胎和不同发育阶段的鼠眼切片上检测Wienholds等[9]鉴定的13种miRNAs,发现6种miRNAs(miR-96、-183、-181b、-213、-216、-217)在所分析的任何发育阶段的小鼠眼中均未检测到,其余的7种miRNAs确实存在于小鼠眼球,并且全部呈现出不同的表达模式。近期有研究在成年小鼠全眼组织中检测miRNAs的表达,发现了10种miRNAs(miR-96、-205、-182、-211、-204、-183、-31、-199a、-184、-210)表达丰富[11]。miR-204和 miR-96在斑马鱼眼和小鼠眼中均表达丰富,表明这些miRNAs在 2种不同的机体中均具有重要作用。

1.2 视网膜m iRNAs表达 Ryan等[12]检测成年小鼠视网膜中miRNAs的表达,发现在视网膜中呈最高表达的是miR-181a、miR-182、miR-183、miR-204、miR-125b、miR-26a和miR-124a。他们应用原位杂交分析幼鼠(生后7 d)视网膜,发现miR-181、miR-182和miR-183之间存在既不相同又重叠交错的表达模式:miR-181强烈表达于神经节细胞层、内丛状层和内核层,外核层几乎没有表达;miR-182均匀一致地表达于视网膜各层;miR-183的表达仅限于外核层,集中于外界膜。同时,他们观察成年小鼠(生后 21 d)眼外核层,发现miR-182和miR-183的表达定位于外界膜。Deo等[13]应用原位杂交分析成年小鼠视网膜上Ryan等[12]鉴定的miRNAs,发现miR-204在视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)和睫状体上呈强表达,并且在RPE上检测出miR-224;相反,miR-124a表达于神经视网膜的全层,而在RPE上无表达。

随后,Karali等[10]用13种LNA-修饰的探针对胚胎期小鼠Embryo 10.5 d(E10.5)及Embryo 14.5 d、生后0 d(P0)及生后8 d(P8)幼鼠以及成年小鼠视网膜进行杂交,发现 miR-204强烈表达于 E10.5的RPE、睫状体和晶状体上皮细胞,而miR-184表达于晶状体和角膜上皮,但在神经视网膜上无表达;miR-182强烈表达于成年小鼠视网膜的光感受器节段,而在眼的其他结构中无表达;miR-124a、miR-9、miR-29、miR-181a均表达于E10.5的视杯以及P0、P8和成年小鼠眼的神经视网膜。

最近,Xu等[14]通过系列研究发现,至少 78种miRNAs在成年小鼠视网膜上存在表达,其中有20种miRNAs优先表达于视网膜,这些miRNAs的表达随鼠龄增长而增加,在成年小鼠视网膜达峰值。同时得出:miR-182、miR-183、miR-96的基因成簇集中于小鼠6号染色体的一个4 kb大小的区域,并被同向转录,表明3种miRNAs可能受到相似的转录调控作用。他们进一步研究发现miR-182、m iR-183、miR-96在视网膜光感受器和内核层的中间神经元上具有相似的表达模式。他们还检测到:在暗适应对比明适应的视网膜中,10种miRNAs(let-7f、let-7i、miR-106b、-30b、-139、-126、-107、-182、-103、-124a)上调,2种miRNAs(miR-422a和miR-422b)下调,表明它们的表达受昼夜节律的影响。这些发现使新近关于果蝇中miRNAs昼夜节律调节的报道受到关注,该研究发现dme-miR-263和dme-miR-263b呈现不同的表达模式,这种不同的表达模式在不能建立昼夜节律的突变体果蝇中消失[15]。而dme-miR-263和dmemiR-263b的序列与小鼠m iR-182和miR-183非常相似,表明果蝇和小鼠miRNAs可能具有相同的功能。

Loscher等[16]证实丰富表达于视网膜上的miRNAs是miR-9、miR-335、miR-31、miR-106、miR-129-3p、miR-691和miR-26b。同时,通过原位杂交分析成功验证了let-7、miR-181a和miR-182在视网膜上的表达,并在1个月龄小鼠视网膜中检测到这3种 miRNAs存在不同的表达模式:在视网膜内核层检测到miR-181a,在外核层的光感受器中检测到miR-182,在内核层和神经节细胞层检测到let-7。

1.3 角膜和晶状体miRNAs表达 Frederikse等[17]应用RNA印迹法证实在啮齿类动物晶状体中存在miR-124、miR-7、miR-125b和let-7a的表达。然而,这些miRNAs在晶状体中的表达没有通过原位杂交的证实。Ryan等[12]发现:miR-184在角膜和晶状体中表现出最高的杂交信号,miR-31和miR-204也呈高水平表达,m iR-125b在晶状体中呈高水平表达。他们应用原位杂交分析揭示miR-184定位于角膜上皮的基底细胞,其表达在角膜上皮创伤后 48 h增高,提示其可能在创伤愈合中发挥作用。在晶状体中, miR-184更强烈地表达于生发区的上皮细胞,然而miR-204均匀表达于所有晶状体上皮细胞。成人晶状体的RNA印迹法检测和新生儿及成人晶状体上皮的原位杂交分析均证实了miR-184和miR-204在晶状体中的表达。

2 m iRNAs与眼部疾病

2.2 miRNAs与视网膜变性

2.2.1 m iRNAs与原发性视网膜色素变性 原发性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一种遗传性视网膜变性疾病,以进行性光感受器细胞丧失致视觉障碍为特征,其最常见的形式为视紫红质(RHO)关联的视网膜变性,占所有常染色体显性RP的25%。Loscher等[18]首次在RP小鼠模型中研究了miRNAs的表达。该研究的RP动物模型为一种携带突变RHO的转基因小鼠,即P374S-RHO转基因小鼠。应用微点阵和qRT-PCR对比检测野生型小鼠和P374S-RHO转基因小鼠的全视网膜miRNAs,结果发现4种miRNAs(miR-1、miR-96、miR-133和miR-183)的表达情况差异明显。他们按照mi-Randa靶点识别系统的预测,鉴定出上述差异表达的每种miRNAs都有400多种可能的视网膜靶点。因此,为了明确miRNAs调节紊乱与眼部疾病的关系, miRNAs在视网膜中复杂的调节作用还有待于更进一步的研究。

由于RHO基因和其他基因如RDS/盘膜边缘蛋白基因(rds)的许多不同的突变可导致RP,在上述研究基础上,Loscher等[18]分析了miR-96、miR-182、miR-183、miR-1、miR-133和miR-142在几种不同的RP小鼠模型(如RHO基因敲除小鼠、rds基因突变小鼠、rds基因307位密码子缺失的转基因小鼠、rds基因先天性无效突变小鼠)全视网膜上的表达。结果发现miRNAs表达改变的一个共同特征:几种RP小鼠模型的视网膜中,m iR-96、miR-182和miR-183的表达下降了14.1%～53.2%,而m iR-1、miR-133和miR-142的表达上调了186.1%～538.5%。用荧光激活细胞分类术检测这些小鼠视网膜的杆状光感受器中siRNAs的表达情况,同样表现出上述变化特征。这说明上述6种表达发生变化的siRNAs可能在RP的发生过程中发挥作用。

2.2.2 miRNAs与视网膜神经变性疾病 Dicer是一种双链的RNA特异性核酸内切酶,能够对miRNAs进行加工处理,使其从没有功能的前体 RNA (70-nt)转变为有功能的分子(21-nt)[19],所以去除Dicer可以导致功能性m iRNAs的显著下降。Dam iani等[20]构建了一个条件Dicer等位基因[21],使其连接到视网膜特异性等位基因Chx10Cre[22]上,导致胚胎期和出生后小鼠视网膜组织中的Dicer均失活,这种小鼠模型中Dicer的失活可能导致大部分视网膜表达的miRNAs总体水平下降,因此可用于评估发育过程及成年小鼠的视网膜中由总miRNAs介导的基因表达的调节作用。所得数据显示视网膜上Dicer的失活导致了广泛的、进行性的m iRNA结构和功能失常,最终导致光感受器介导的对光反射丧失及视网膜大部分变性。此外,Damiani等[20]在转基因小鼠出生后 16 d观察到神经发育的形态学缺陷,随着鼠龄的增长,这种形态学缺陷进一步加重了细胞组织结构紊乱和视网膜细胞变性,同时伴随着明、暗ERG反应的下降。上述结果表明,miRNAs可能参与视网膜神经退行性疾病的发生。

2.3 m iRNAs与眼部新生血管 新生血管性眼病是眼科难治性疾病,也是很多眼病致盲的重要原因,如糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等。视网膜新生血管(neovascularization,NV)、脉络膜NV以及其他组织的NV具有一个共同的特征,即血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是NV极其重要的刺激因子[23-24]。转录水平的调节对NV刺激因子和抑制因子间的平衡起决定作用。越来越多的证据表明miRNAs发挥补充作用:转染 miR-221/miR-222[25]或Dicer敲除所致的总miRNAs的改变[26],可以减少培养的血管内皮细胞的迁移和管腔形成。进一步研究发现,靶向破坏Dicer的小鼠在胚胎阶段死亡,是因为血管发育受到破坏[27]。以上结果表明m iRNAs对血管发生发挥作用。Shen等[28]的研究发现,在缺血的视网膜中,7种miRNAs(miR-106a、-146、-181、-199a、-214、-424、-451)表达大幅升高,3种miRNAs(miR-31、miR-150、miR-184)明显降低;正常视网膜中存在的miR-31、miR-150、miR-184在缺血视网膜中显著降低;眼内注射pre-miR-31、miR-150或miR-184显著减少了缺血诱导的视网膜NV形成,注射pre-miR-31或miR-150也显著降低了脉络膜NV。以上结果表明:miRNA水平的变化对2种类型的眼部NV形成均有影响,注射或提高miRNAs的表达是一种可能的治疗策略。

3 眼的miRNAs靶点

为了理解miRNAs如何在眼中发挥作用,需首先鉴别和证实各种miRNAs的靶基因。Arora等[29]应用TargetScan(http://www.targetscan.org/)预测miRNAs的结合位点在 320个视网膜表达基因的3'非翻译区,随后验证了预测的11种miRNAs(miR-7、miR-23a、m iR-29、miR-107、miR-124、miR-135a、miR-135b、miR-143、miR-200b、miR-206和Let-7b)。Xu等[14]验证了miR-182和miR-96的预测靶点,即位于腺苷酸环化酶VI(Adcy6)和小眼畸形相关转录因子(Mitf)的3'非翻译区。Shen等[28]鉴定了3种miRNAs(miR-31、miR-150、miR-184)的靶基因,结果发现:Pdgfb、Hif1α是miR-31的靶基因,Vegf、Pdfgb是miR-150的靶基因,Frizzled4是否为miR-184的靶基因仍不确定。上述几种m iRNAs靶基因的确定有助于深入研究它们在眼部疾病中可能发挥的作用及机制。

4 展望

相对于癌细胞、血液及肌肉组织中m iRNAs的研究现状,眼部m iRNAs的相关研究不多。有文献报道了miRNAs在果蝇、斑马鱼、啮齿类动物眼中的表达情况,而灵长类动物、尤其是人眼中miRNAs的表达情况仍有待进一步证实。此外,许多miRNAs表现出独特的组织特异和发育阶段特异的表达模式,提示它们在眼中具有独特的功能,但其对眼的发育、正常功能以及病理状态的作用机制仍处于探索中,有望通过鉴定一些在眼中特异性高表达的miRNAs对应的靶基因来阐明。

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