线栓法致大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的制作及思考

汪 亮，刘潘潘，胡勤乐

(1．宁波大学医学院研究生部，浙江宁波315211;2．浙江大学医学院研究生部，杭州310058;3．宁波市第一医院神经外科，浙江宁波315010)

随着人口的老龄化，脑血管疾病已经成为世界上危害人类健康的三大疾病之一。我国每年新发脑卒中病例已超过200万，其中缺血性脑卒中占80%以上，其致残率和脑损伤程度均超过脑出血。而缺血性脑血管疾病中，尤以大脑中动脉闭塞最为常见［1］。因此制备一种理想的大脑中动脉脑缺血/再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)是研究缺血性脑血管病的前提条件。目前，制备MCAO/R模型的方法较多，其中线栓法致MCAO/R模型备为推崇。线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞缺血模型不需开颅，创伤小，不影响脑缺血后脑水肿和颅内压等病理变化，特别适合于局部损伤后脑功能改变及治疗药物评价等实验研究［2，3］。本研究在参考一些经典线栓法的基础上，对“脑缺血/再灌注损伤保护”进行思考、探索，为研究局灶性脑缺血/再灌注损伤提供一种较为理想、可靠且操作较为简便的实验动物模型制作方法。

1 材料与方法

1．1 实验动物 健康雄性大鼠32只(体质量250～280 g)，由浙江省医学科学院提供。随机分为2组，手术组和假手术组分别为20只和12只。

1．2 栓线准备 市售3-0号鱼线，直径为0．256 mm。其制备方法:先浸入0．1%多聚赖氨酸溶液中，再放入50℃烤箱中干燥，取出后头端涂以硅橡胶，然后悬挂阴干。

1．3 模型制备 大鼠经10%水合氯醛(0．4 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台上，颈部皮肤备皮消毒，取颈部右侧旁正中切口，钝性分离皮下组织、右侧胸锁乳突肌及颈前部肌群，然后暴露并游离右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)约1 cm，并于近心端将之结扎，远心端(靠近CCA及分叉处)挂线以便于牵拉和向远端分离，并可在后续操作中防止栓线滑落和减少出血。操作中注意仔细分离迷走神经，避免牵拉损伤迷走神经而致呼吸骤停。找到CCA分叉后，继续分离颈外动脉(external carotid artery，ECA)将之结扎，牵拉ECA进一步分离颈内动脉，并挂线向远端进一步分离颈内动脉(internal carotid artery，ICA)主干以便于调整插线方向与角度。用眼科剪于CCA结扎的远心端(距CCA分叉处约2 mm)斜行45°剪一小口并导入栓线，导入后单结稍打紧预留在CCA的挂线以减少出血，调整好插线方向及角度，栓线经CCA顺利进入ICA，此时放松CCA单结，继续将栓线往前推送，直至到达大脑中动脉起始部，遇阻力停止，长度18～20 mm。双结打紧住栓线，确认无出血后缝合皮肤，术后1．5 h后抽出线栓。假手术组只结扎CCA而不导入线栓。

1．4 神经功能缺损评分 大鼠缺血/再灌注24 h后，对其进行神经功能缺损评分。参照经典的Zea Longa法［4］:无神经功能缺损症状为0分;轻微神经功能缺损，不能完全伸展对侧前爪为1分;中度局灶性神经功能缺损，向对侧转圈为2分;重度局灶性神经功能缺损，向对侧倾倒为3分;不能自发行走且意识水平下降为4分。

1．5 氯化三苯四氮唑(tetrazolium chloride，TTC)染色 大鼠缺血/再灌注24 h后给予左心室磷酸盐缓冲液灌注，然后断头取脑，取脑时发现有蛛网膜下腔出血者给予排除;取出鼠脑后置于－20℃冰箱中快速冰冻约15 min，然后冠状位均匀切成2 mm厚度脑组织5～6片;将切好的脑片置于2%的TTC磷酸盐缓冲液中，避光后给予37℃恒温水箱孵育15～30 min，待完全显色后置于4%多聚甲醛固定。

2 结果

2．1 大鼠神经行为观察 大鼠脑缺血/再灌注24 h后，手术组有15只大鼠神经功能缺损评分为1～2分，出现行走时左侧肢体伸展不全，以前肢为重，有部分大鼠可出现向对侧转圈，提起鼠尾时左侧前肢无力屈曲，反抗力明显减弱;1只大鼠在麻醉后手术过程中死亡;1只大鼠取脑时发现存在蛛网膜下腔出血;2只大鼠神经功能缺损不明显，评分为0～1分;1只大鼠术后神经功能缺损评分可达3～4分，24 h后发现已死亡。模型成功率为75%。假手术组神经行为则与正常小鼠无明显差别。

2．2 TTC染色 存活大鼠24 h后取脑切片，手术组造模成功大鼠脑冠状切面经TTC法染色后，可见右侧尾状核及额顶皮质不同程度的苍白色梗死区。假手术组TTC染色后为正常红色脑组织。

3 讨论

3．1 动物选择 大鼠的神经系统脑血管变异较少，种系纯性好，价廉易得，具有极强的抗感染能力，已成为目前最常用的局灶性脑缺血模型动物材料。而在不同的大鼠品种之间，SD大鼠进行MCAO/R建模后，梗死面积较大较固定且价廉易得，故采用SD种系大鼠为建立MCAO/R模型最常用大鼠。老龄大鼠大脑中动脉已发生不同程度的动脉扭曲或官腔狭窄，使得线栓难以推进，故在目前实验操作中，仍以青壮年雄性大鼠作为实验对象［5］。

3．2 麻醉剂的选择 制作MCAO/R模型可有多种麻醉剂选择，国外制作该模型目前多采用氟烷诱导麻醉，继以将氧化亚氮与纯氧按比例混合后，行机械通气维持吸入麻醉，但价格昂贵，步骤繁琐。而国内学者多用10%水合氯醛腹腔内注射，国内张彦等［6］认为，采用10%水合氯醛作为制作MCAO/R模型的麻醉剂效果较好。

3．3 线栓选择及处理 辛世萌等［7］曾通过大量研究实验，提出线栓直径及插入的长度应与大鼠体质量呈正比，大鼠体质量250～330 g，插入线长17 mm或18 mm，栓线直径0．28 mm为最佳匹配方案，制作的MCAO/R模型成功率高、重复性好、生理指标影响小，适合用于探讨脑缺血/再灌注机制及评价药物疗效。最近郑建明等［8］通过研究指出，使用直径为0．28 mm和头端直径为0．32～0．34 mm的栓线能较为显著地提高模型的稳定性。国外文献已有报道，相同号码线栓对不同体质量大鼠造模效果不一致［9］。本研究采用250～300 g大鼠，线栓进入长度18 mm左右，结果20只中仅有1只出现蛛网膜下腔出血，考虑原因是栓线穿破颅底动脉，或是栓线与颅底动脉产生粘连，在拔栓线时将颅底动脉撕破所致。另外2只神经功能评分为0～1分，TTC染色为较小范围梗死灶，考虑为栓线插入过短从而未导致完全性大脑中动脉闭塞。国外学者Durukan等［10］也指出这种模型存在一些缺点:①易出现蛛网膜下腔出血，病死率较高;②常出现不能完全闭塞大脑中动脉的现象。栓线头部的正确处理已经公认成为影响制备大鼠MCAO/R模型的重要因素，有学者曾提出可将栓线头端烫成光滑的圆球。Ma等［11］将更细直径的6-0单股尼龙线表面涂以硅树脂制备的栓线，经ICA超选择性进入大鼠的大脑中动脉。而本研究采用的栓线头端覆以左旋多聚氨酸，从而使线栓与血管壁的黏附性增加，弥补了大鼠体重及血管大小的个体差异所致的线栓表面与血管壁间的微小间隙，从而完全阻断血流，可以增加缺血稳定性。总之，线栓端部如何处理还需要大量的实验研究，线栓端部处理是否合理已经公认为实验成功的关键。

3．4 手术方式的选择 线栓的插入传统上有两种方法:一种是采用从ICA或CCA插入线栓。另一种方法是采用颈外动脉切口，插入后向下，轻按ECA使之与ICA成近似直线，顺ECA走向在颈内动脉中缓慢推进直至感觉有少许阻力为止。由于缺少经验，本组采用了第一种线栓插入方法，即从CCA插入线栓，效果较为满意。而王毅刚等［12］采用了距CCA分叉1 cm处的切口，不分离ECA和ICA，且不结扎ECA的手术方法，通过调整进线角度使线栓从CCA顺行进入ICA，进而入颅堵塞大脑中动脉，取得良好效果。在模型制作过程中，遇到的最大困难是栓线插线时的大出血，以及有时栓线无法正确插入ICA，故除了用血管夹夹闭ECA、ICA外，可直接在ECA、ICA套上一根丝线牵拉，既有助于手术分离，又有助于控制出血。武强等［13］的模型做法是先以2个微动脉分别夹闭CCA和ICA，然后切断ECA，由断端送入栓线至CCA分叉处，然后翻转方向，松开夹闭ICA的微动脉夹，将栓线向内上方向角度缓慢在ICA内推进。若线栓误入翼腭动脉，则可先用微动脉夹临时夹闭。国内孙宇等［14］学者指出，通过永久结扎大鼠颈总动脉近心端，不游离翼腭动脉，由颈总动脉分叉处将线栓插入大脑中动脉方法制备MCAO再灌注模型是可行的，能明显减少造模的时间。而本组在操作上也未对大鼠的翼腭动脉加以分离及处理，因为翼腭动脉位置深在，若结扎该动脉，神经肌肉损害严重，可能会引起进食困难，给大鼠造成极大伤害，增加大鼠的死亡率。在手术操作过程中，保持室温在25～30℃，在分离动脉过程中，注意保护沿着ECA、CCA走行的迷走神经，防止呼吸道分泌物过多。呼吸道分泌物过多时可适当吸痰，术后注意保温，这些措施可以提高动物的生存率。

目前，MCAO/R模型在制备方法、实验条件的控制等方面都取得了很大进展。转基因大鼠的出现，超声、介入等新技术的发展及其在模型制备中的应用，也在很大程度上促进了MCAO/R模型的研究。线栓制备MCAO/R模型的影响因素较多，最近国外有文献指出大鼠的年龄和性别都严重影响着该模型的效果［15］，故应该首先对整体的实验体系进行全面评估和调整，尽可能优化制备MCAO/R模型的实验条件，从而制备出可靠、稳定、重复性好、成功率高的理想的MCAO/R模型，为脑缺血病理生理的研究和治疗药物的研制发挥更加科学有效的作用。

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