p53靶位基因Wig-1——肿瘤与干细胞新的调控因子

曾 英(综述)，肖华亮(审校)

(第三军医大学第三附属医院野战外科研究所病理科，重庆400042)

抑癌基因p53通过修复损伤DNA和抑制癌基因激活发挥抑制肿瘤发生的功能，激活p53使细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡［1，2］。p53人类肿瘤中突变频率达50%［3］。p53发挥抑瘤功能主要是作为转录因子调节其靶位基因的表达，因此深入研究p53靶位基因的功能对完全阐明p53的功能是至关重要的。Wig-1(wild-type p53-induced gene 1)是p53基因的靶位基因之一，野生型p53可以激活Wig-1诱导细胞凋亡，研究发现Wig-1作为p53信号通路下游分子具有重要功能，阐明Wig-1的功能对于全面理解p53信号通路具有重要意义。

1 Wig-1蛋白的结构和功能特征

Wig-1，也叫 PAG608 或ZMAT3，是最早作为 p53的转录调节的直接靶位基因发现的。小鼠的 Wig-1是在J3D小鼠T淋巴瘤细胞(带有温度敏感的Val135突变p53元件)中发现的［4，5］。另一个实验室用相似的方法在小鼠髓细胞性白血病细胞系LTR6克隆出同样的基因，命名为PAG608［6］。后来不同的研究小组克隆了人 Wig-1，并证实 Wig-1是 p53的靶位基因［7，8］。人 Wig-1 8 kb 和6 kb 转录本在结肠癌细胞系HCT116和LoVo(带有野生型TP53)表达上调，但是在缺少野生型TP53的DLD1细胞系中表达不上调，说明p53能够诱导Wig-1表达。野生型p53使Wig-1的mRNA和蛋白水平表达上调，过表达Wig-1基因可以抑制肿瘤细胞的生长，表明Wig-1基因可能在依赖p53的生长调控途径中起作用。

Wig-1位于人染色体3q26．32，全长2432 bp，及6个外显子，包含870 bp的开放性阅读框，其蛋白结构存在2种亚型，两者仅差别一个氨基酸，Wig-1开放阅读框包含288或289氨基酸，开放阅读框后面带有包含3个polyA的3'UTR，大约长8 kb。Wig-1包含3个带有Cys2His2锌指结构蛋白及一个核定位信号。锌指结构之间的组氨酸距离由5个氨基酸代替正常3～4个氨基酸，锌指结构之间连接也是由56～75氨基酸代替大多数锌指结构的6～8个氨基酸，这种锌指结构极为罕见，是缺乏一致双链RNA(doublestranded RNA，dsRNA)结合模序的dsRNA结合蛋白所共有的，这组dsRNA结合蛋白在结合特异性、结合紧密程度及结合跨越空间上均具有较强的灵活性。现在研究最为清楚的dsRNA结合蛋白是JAZ，JAZ结合dsRNA核输出受体Exportin-5［9］，通过结合p53蛋白从而正向调节 p53转录活性［10］。像 JAZ一样，Wig-1也是一种RNA结合蛋白，它可结合＞50 bp的dsRNA，也可以结合单链RNA和RNA-DNA杂交分子，但是dsRNA是其最佳靶位［11］。第一锌指结构和第二锌指结构对于结合 dsRNA 是必需的［11，12］。Wig-1也可以结合大约21 bp的短链RNA，但仅是这些类似microRNA(miRNA)的小RNA。Dicer是一种对miRNA成熟至关重要的核糖核酸酶Ⅲ，Wig-1在缺失Dicer的胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)中表达下调，这提示Wig-1可能具有和miRNA相关的功能［13］。

Wig-1在结构上从鱼类到人类都是保守的，特别是锌指结构部分几乎完全保守［14］。人和小鼠在蛋白质水平有87%同源，除了第三个锌指结构中一个氨基酸置换外，其余锌指结构均保持一致，同时锌指结构之间的距离也是保守的［14］。

2 Wig-1的表达与调控

Wig-1的表达极为广泛［7］，几乎在所有检测的组织中均有Wig-1表达，但在脑组织中表达水平最高，BioGPS(http://biogps．gnf．org)表达数据也证实Wig-1在所有组织表达基础水平，在脑组织特别是在杏仁核和额叶前皮质表达水平最高，在平滑肌、心肌细胞、脂肪细胞表达水平较高。

人Wig-1在内含子1含有功能性的p53反应元件，小鼠Wig-1启动子区域内包含2个功能性的p53结合位点，说明 p53 可以直接调节 Wig-1［5，8］。3 个研究小组证实Wig-1是p53靶位基因［4-8］，芯片数据也显示使用小分子RITA激活p53以后，Wig-1表达上调［15］。此外，使用化疗药物氟尿嘧啶处理造血干细胞后引起DNA损伤，也可诱导Wig-1表达，这些均证明 Wig-1受 p53的调控［16］。

但是，同样也观察到在缺乏p53的细胞中，Wig-1仍维持较高水平，说明p53并不是调节Wig-1表达的唯一转录因子。通过数据库(pscan:http://159．149．109．9/pscan/和 genomatix:http://www．genomatix．de)搜索，根据搜索数据库和搜索参数的不同，得到Wig-1启动子区域包含45～130个假定转录因子结合位点的结果，包括Myf5(myogenic factor 5)、FEV(fifth ewing variant，)、SPI1(spleen focus forming virus proviral integration oncogene)、Spz1(spermatogenic leucine zipper 1)、Pou5f1(POU class 5 homeobox 1)、GABPA(GA-binding protein alpha)、TP53、Nr2e3(nuclear receptor subfamily 2，group E，member 3)、Sox2(sex-determining region Y-box 2)、HLF(hepatic leukemia factor)等转录因子结合位点，这表明Wig-1接受多种转录因子严密调控。根据Pscan预测，p53是人和小鼠Wig-1候选转录因子排名最靠前的，可结合到Wig-1启动子区域，这和前面的实验结果一致［4-7］。根据预测的Wig-1转录因子谱，发现Wig-1在多种组织(肌肉、大脑、晶状体、造血干细胞、ES细胞)中表达，受到复杂的调节，这与检测到Wig-1在多种组织广泛表达一致。根据Pscan预测，发现Wig-1既能被抑瘤基因p53又能被一些促进细胞生长和具有癌基因特征的转录因子，如spz1、Pou5f1和SPI1激活，表明Wig-1可在不同的细胞环境下诱导表达。另外，Wig-1候选转录因子(如Pou5f1和Sox2)对ES细胞生存至关重要，说明Wig-1可能是ES细胞一个新的调节因子。

为进一步研究上游调节信号通路对Wig-1表达的调控，对调控Wig-1的候选转录因子进行基因功能分类(gene ontology classifications:http://www．pantherdb．org)分析，结果显示这些转录因子参与了白细胞介素、胰岛素/胰岛素样生长因子、转化生长因子β、血小板源性生长因子、氧化性应激、Ras、Toll-受体、凋亡、Wnt、趋化因子和细胞因子介导的炎症、p53调控环路等信号通路，表明Wig-1参与了多种细胞活动过程。这些转录因子与重要的促进生长的信号通路相关，还有些信号通路跟Wig-1在p53网络中的作用一致，如氧化应激反应、凋亡及p53反馈环路。根据以上信号通路分析发现，p53确实是Wig-1上游重要的激活子。总之，多种转录因子参与的信号可激活Wig-1，而不管p53表达与否，但是DNA损伤后Wig-1的表达需要有功能的p53。

3 Wig-1的功能

研究显示，外源性表达Wig-1可长期抑制细胞生长，但不影响细胞周期分布和细胞死亡;而使用小干扰RNA降低Wig-1表达，也可导致细胞活性下降，这表明Wig-1表达过低或者过高都不利于细胞生长。使用质谱分析法鉴定Wig-1相互作用的蛋白，发现RNA解旋酶A(RNA helicase)和不均一核糖核酸核内核糖核蛋白A2/B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1，hnRNPA2/B1)以依赖 RNA的方式结合到 Wig-1［17］，然而这两个蛋白均为多功能RNA结合蛋白，因此很难从这些RNA依赖的相互作用中单独鉴定Wig-1的功能。与hnRNPA2/B1调节mRNA稳定性一样，研究发现，Wig-1通过结合p53 mRNA的3'UTR的富含尿嘧啶(U)区，稳定 p53 mRNA，正向调节p53 mRNA，形成正向调节反馈环路。AREs由AUUUA组成或者连续几个U组成，富含U区是AREs元件的一个子类，出现在8%的转录组中特定mRNA的3'UTR［18］，调节mRNA稳定性和翻译，使这些基因的mRNA表达得到精细调控，包括可调节细胞生长或对外部因子作出细胞反应的基因，如 c-Myc、N-Myc、细胞周期调节蛋白、干扰素、p53及 p21［19，20］。AREs一般是负向调节基因表达，通过增加脱腺苷化作用促进mRNA降解，脱腺苷作用是mRNA降解的第一步也是限速步骤，同时加快mRNA衰变。AREs也可以降低翻译效率。大部分结合和调节AREs的因子通过促进mRNA降解和抑制翻译负向调节靶位mRNA［21］。然而也有主要表现为正向调节作用的AREs，如广泛表达的人抗原R，AREs调节子根据所结合的mRNA表现为正向或者负向调节作用［22］。

ARE结合蛋白(ARE-binding proteins，ARE-BPs)能在细胞水平调控多种mRNA，因此被认为是重要的调节点［20］。p53基因的3'UTR包含一个富含尿嘧啶U区域(连续18个U)和另一个ARE［23］，两者均被几个ARE-BPs调节。Wig-1结合到p53 mRNA，通过阻止mRNA脱腺苷作用稳定mRNA［24］，这增加p53蛋白质水平，增强p53对DNA损伤反应。另有研究表明，抑制Wig-1同源类似物PAG608引起依赖p53的诱导细胞死亡作用减弱。大部分ARE-BPs调节多种mRNAs，研究也显示Wig-1可以靶向除p53以外的其他包含ARE的mRNA。

4 Wig-1在肿瘤疾病、非肿瘤性疾病及干细胞中的研究

4．1 Wig-1与肿瘤 Wig-1在多种肿瘤细胞系及不同组织来源的原代细胞中均表达，但Wig-1在不同的肿瘤细胞系和肿瘤组织中表达水平不一致(来自http://biogps．gnf．org)。例如在 HCT116、SKOV-3、HT-29、HEK293、MCF7、T3M4、SN12C 表达降低;而在HeLa、HT1080、Jurkat、SHSY-5Y、U2OS、UACC62、SKMEL5、LNCAP表达升高。乳头状甲状腺癌较正常组织表达升高，鳞状细胞癌与正常组织表达差异不明显，乳腺浸润性导管癌及乳腺浸润性小叶癌中表达均下降。

Wig-1位于染色体3q26．32区域，该区域在头颈、乳腺、卵巢、宫颈、前列腺、食管、鼻咽、肺鳞状细胞癌及急性髓细胞样白血病中均有扩增，这表明Wig-1在这些肿瘤中也可能扩增，也有实验证实Wig-1在肺癌中过表达［7］。然而，Wig-1所在的染色体区域也存在几个肿瘤相关的基因，如端粒酶RNA元件和Bcl-6，所以Wig-1是单基因扩增还是作为伴随基因共扩增仍需要进一步研究。此外，Wig-1能同时被肿瘤抑制基因(如p53)和具有癌基因活性的转录因子激活，研究中也发现过表达 Wig-1和降低Wig-1表达均可抑制细胞生长，而在肿瘤组织中Wig-1表达升高和降低均有报道，因此，就目前的研究还不足以界定Wig-1是抑瘤基因还是癌基因，需要深入研究Wig-1在肿瘤中的功能。

4．2 Wig-1与非肿瘤性疾病 研究发现，大鼠Wig-1的类似物PAG608在大鼠神经系统不同区域均表达相对较高的水平，在局部缺血、使用甲基苯丙胺处理大鼠、肌萎缩性侧索硬化症模型的早期、Parkinson疾病模型，均可诱导Wig-1表达。另外也有研究显示，PAG608在大脑处于应激作用下发挥预凋亡(pro-apoptotic)功能。总的来说，Wig-1/PAG608可在神经系统应激反应和病理条件下发挥作用。

4．3 Wig-1与干细胞 在干细胞中Wig-1表达升高。比较造血干细胞、神经干细胞、ES细胞及与之相应的分化细胞表达，研究发现Wig-1在三种干细胞中表达水平较分化细胞高表达［25］。Bmi-1是维持造血干细胞自我更新的一个必需因子，在缺失Bmi-1癌基因的造血干细胞，Wig-1表达上调［26］，与此同时伴随成体造血干细胞丢失，这是由于Wig-1表达水平升高促进造血干细胞丢失，还是缺失Bmi-1后所发生的代偿机制，这仍需进一步研究。此外，Wig-1在红细胞生成过程中表达下调，这与Wig-1维持造血干细胞和造血祖细胞干性功能一致。

另外，生物芯片研究结果证实Wig-1在生殖细胞和ES细胞中发挥作用。例如，使用神经胶质细胞源性神经元营养因子和神经胶质细胞源性神经元营养因子家族受体α1刺激精原干细胞可诱导Wig-1表达［27］。这些研究表明，生长因子刺激干细胞以后诱导Wig-1表达。与Wig-1在干细胞中的作用一致，Wig-1在受精前的小鼠卵母细胞低水平表达，这种水平维持至E4．5胚胎表达升高。观察到使用shRNA干扰Wig-1的表达以后，降低干细胞表型，表明Wig-1能维持胚胎干细胞干性［28］，生物信息学也预测Wig-1候选转录因子包含2个ES细胞必需转录因子Pou5f1和Sox2。

5 存在的问题

p53靶位基因Wig-1参与基因转录后水平调节，表明p53及其下游靶位Wig-1所参与一个全新的基因调节，p53除了直接转录靶位，还在mRNA水平调节不同的靶位［29］，p53通过调节mRNA的稳定性或者翻译，精细调节其转录靶位。然而，仍需解决以下问题:鉴定Wig-1新的靶位及调控Wig-1的转录因子;确切阐明Wig-1功能及Wig-1发挥功能的具体机制，Wig-1是否能参与重编程，使成体细胞恢复干细胞特性;Wig-1在肿瘤干细胞中的表达如何?是否也参与维持肿瘤干细胞的自我更新和分化?只有解决这些问题才能全面阐明Wig-1在转录后水平调节基因表达和细胞生物学功能。

6 结语

随着研究的深入，越来越凸显p53调节网络的复杂性。p53有除细胞周期调控和应激条件下诱导细胞凋亡功能以外，还有调节细胞新陈代谢的作用，低基础水平的可促进细胞存活，p53靶位基因Wig-1正好具有这些功能，Wig-1诱导细胞周期阻滞或凋亡，并且在翻译后水平调节基因表达。Wig-1在所有真核细胞生物结构保守，因此Wig-1对维持细胞的基本活动和调控细胞命运具有重要作用。然而，Wig-1的功能及生物学意义的研究才刚刚起步，还需要更多、更深入的研究，才能完全阐明其功能和生物学意义。

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