量子点在生物大分子检测中的研究进展

李志刚(综述)，杨 凯(审校)

(重庆医科大学附属第一医院口腔颌面外科，重庆400016)

半导体量子点(semiconductor quantum dots，QDs)或称为半导体纳米微晶体，是一种由Ⅱ～Ⅵ族元素(如硒化镉、硫化镉等)或Ⅲ～Ⅴ族元素(如磷化铟、砷化铟)组成的尺寸＜100 nm的半导体纳米晶体。1998年，Chan等［1］通过在量子点表面上连接巯基乙酸从而改变了量子点的生物相容性。Bruchez等［2］通过在量子点表面包上二氧化硅再连上羟基解决了量子点的水溶性问题，从而为量子点在生物医学方面的应用提供了可能。在过去的10多年中，人们将量子点用于检测体内外生物分子的标志物、细胞和药物的示踪剂等研究，证明量子点是最具有发展前景和理想的生物检测荧光探针之一［3-5］。生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子质量达到上万或更多的有机分子，常见的生物大分子有蛋白质、核酸、脂类、糖类等，对其研究具有重大意义。现总结近年来量子点在生物大分子研究方面的应用进展。

1 量子点在生物大分子定位和功能方面的应用

近年来人们用量子点对生物大分子定位和功能进行研究。Bae等［6］将Ni-NTA(His标签蛋白纯化试剂)与QDs连接制备Ni-NTA-QDs探针，用于对人骨肉瘤细胞内组氨酸标记的融合蛋白的定位检测，证明了Ni-NTA-QDs特异性定位于组氨酸标记的融合蛋白的6 x区域，同时也为Ni-NTA-QDs与组氨酸标记的蛋白在活细胞内进行追踪观察提供了可能。Månsson等［7］用链霉亲和素包裹的量子点标记肌动蛋白丝后在体外研究肌动蛋白丝的滑行，观察到肌动蛋白丝滑行的时候沿着自己的长轴旋转，用偏振显微镜检测到量子点在三维空间中的定位，这为利用量子点在三维空间中研究肌动蛋白丝动态滑行过程提供了可能，也为对肌动球蛋白和其他生物分子的功能研究打开了新窗口。Hu等［8］用无机颗粒碳酸氢钙包埋碲化镉，形成了具有良好生物相容性的碳酸氢钙碲化镉颗粒，与肝癌细胞株共同培养，用荧光显微镜观察了量子点在细胞内的吸收和分布。同时通过激光扫描共聚焦显微镜监控细胞对碳酸氢钙碲化镉的吸收过程，在前3个小时碳酸氢钙碲化镉聚集在肝癌细胞株细胞膜周围，少量黏附在细胞膜上。经过24 h的共同培养后，大部分碳酸氢钙碲化镉围绕和黏附在细胞膜上，小部分进入了细胞内，共聚焦图像提示进入细胞内的碳酸氢钙碲化镉位于溶酶体，颗粒通过与细胞的非特异性相互作用的吞噬路径进入细胞内。该实验显示了碳酸氢钙碲化镉进入细胞的过程以及最后的定位的细胞器，这为以后的研究提供了新的方法。

2 量子点在对生物大分子识别和鉴定方面的应用

由于人类基因组计划还未完全发现人类基因组序列，而完成人类基因组序列需要通过DNA杂交的检测，这就使得DNA杂交的检测变得很重要。Jiang等［9］发现了一种利用水溶性量子点参与的级联荧光能量转移来检测DNA杂交的新方法，用400 nm光激发二溴化聚乙烯、量子点和红外线染料700染料标记的DNA混合物，第一级联反应从二溴化聚乙烯到量子点发生能量转移，第二级联反应从二溴化聚乙烯/量子点混合物到红外线染料700染料标记的DNA发生能量转移，该方法提供了可靠的信号感应平台，从而区别了互补与非互补的DNA，这为完成人类基因组计划提供了可能。Giraud等［10］发现量子点标记与荧光寿命成像显微术联合应用是一种强有力的转导技术，量子点标记的靶DNA杂交微阵列点荧光寿命分析显示有18.8 ns的特征寿命值，与游离的量子点溶液所获得的13.3 ns的特征寿命值相比，揭示了量子点标签对点微环境的敏感性，并用于对DNA杂交事件的检测。Wu等［11］用紧凑的量子点探针通过高效的荧光能量转移快速且敏感地检测DNA，将量子点表面包裹羧基组和非功能化的氢氧根来减少空间障碍，合成量子点DNA探针，使功能化的量子点的尺寸在3 nm左右，并用这种量子点来检测DNA，只需10 min即可在纳摩尔检测限内完成DNA的快速检测。Wu等［12］将量子点与巯基化的单链DNA结合，建立了一种量子点标记DNA的荧光探针，通过荧光素原位杂交技术对大肠埃希菌pUC18质粒上的多克隆位点序列进行了研究。张渝阳等［13］利用碳纳米管和碲化镉QDs组装的电化学传感器建立了一种识别DNA的新方法，用羧基化碳纳米管修饰在金电极上，用此电极固定5'端氨基探针DNA，以碲化镉QDs为互补的目标，DNA标志物在溶液中杂交后通过差分脉冲检测嵌合指示剂柔红霉素的还原峰信号，从而定量检测目标DNA。标记碲化镉QDs的目标DNA序列与未标记碲化镉QDs的目标DNA相比，电流响应敏感度明显提高，从而建立了一种新的识别DNA的电化学传感器。

3 量子点在生物大分子相互作用机制方面的应用

用量子点标记有关的生物分子，通过对量子点的测定即可实时观测活体细胞内部特定受体及生物分子之间的相互作用，研究活体细胞内的信号传递及其分子机制。Vu等［14］用量子点与神经生长因子连接制备神经生长因子-量子点探针，神经生长因子-量子点探针与大鼠嗜铬细胞瘤细胞表面的TrkA受体作用后，激活TrkA受体而引起大鼠嗜铬细胞瘤细胞信号转导的级联反应，刺激神经元分化，为量子点应用于生物大分子间的相互作用研究提供了可能。Chen等［15］将三磷酸腺苷加入到Cy5标记的DNA和量子点标记的DNA溶液中，由于三磷酸腺苷与适配体间的相互作用引起适配体构造的改变，使Cy5标记的DNA从杂交复合体中释放出来，从而触发量子点荧光强度增强和Cy5荧光强度减低，建立了一种量子点参与的有效率地检测三磷酸腺苷的新方法。这种方法在将来可以更加深入地研究DNA与DNA或者DNA与蛋白质的相互作用。Weng等［16］将量子点分别与抗von Willebrand因子抗体和植物凝集素进行共价配对制备荧光量子点抗von Willebrand因子抗体和量子点植物凝集素，将其分别与相应的细胞质免疫原和细胞膜受体进行特异性结合，通过激光共焦扫描显微镜获得了很好的细胞成像，证明了量子点在生物分子间相互作用的研究方面可提供直接可视化的直观方法。

4 量子点在生物大分子运动轨迹监测方面的应用

Ishihama等［17］将量子点标记的mRNAs通过显微注射入Cos7(猴肾成纤维细胞系)细胞的细胞核，在30 ms的时间分辨率下，成功地应用量子点对mRNAs的运动进行实时动态观察超过60 s，通过该实验证实了mRNAs的扩散只在染色质区域内而不是在核染色质区域，这为mRNAs的扩散渠道是在染色质区域内提供了直接证据。杨凯等［18］利用 QDs与Smad4单克隆抗体连接形成QDs-Smad4荧光探针，用于对牙乳头细胞内Smad4信号蛋白分子核移位过程进行了检测，证明了QDs和Smad4单抗共价结合形成分子探针后仍具有独特的光学性质和特异免疫识别能力，能长时间对细胞内蛋白质分子进行成像标记。Dahan等［19］用链酶亲和素包裹的量子点与mAb2b抗体、生物素化的抗鼠Fab片段及甘氨酸受体共同作用形成量子点-甘氨酸受体探针，用于对神经元上甘氨酸受体的检测，通过激光共聚焦显微镜在从毫秒到分钟的时期范围内跟踪甘氨酸受体，分析它们在活细胞的神经元膜上的外侧动力学。通过电子显微镜观察到量子点标记的甘氨酸受体通过扩散的方式进入突触，证实了扩散的量子点甘氨酸受体精确地定位在神经元膜上。

5 量子点在生物大分子定量检测方面的应用

由于量子点在生物大分子定量检测中具有简便、快速的特点，以及较高的特异性和敏感性，所以量子点用于生物大分子的定量检测越来越多。Chen等［20］发明了基于量子点的免疫荧光技术定量检测人类表皮生长因子Ⅱ在乳腺癌中的表达。在94例乳腺癌临床病例中，通过用量子点定量检测人类表皮生长因子Ⅱ在乳腺癌中的表达，提高了乳腺癌临床诊断的精确度和敏感度。Zhang等［21］建立了夹心免疫荧光测定人甲胎蛋白抗原模型，将量子点与IgG抗体结合，同时用抗原包裹羧基聚苯乙烯微磁球，两者通过抗原抗体反应相结合，可以对甲胎蛋白定量检测到4.9 μg/L。Liu等［22］建立了一种基于细菌壁表面蛋白的量子点传感器，应用量子点标记 IgG并通过离心分离出待测细菌，最后通过荧光测定来判断金黄色葡萄球菌的浓度，该研究提供了一种快速、准确的定量检测方法。黄珊等［23］采用共振光散射方法研究了溶菌酶与量子点之间的相互作用，并利用量子点探针建立了检测溶菌酶的新方法，检出限达到5.2 nmol/L，并将此方法成功用于合成样品中溶菌酶含量的测定。Yu等［24］用合成的功能化的碲化镉/硫化镉量子点QDs与克拉克鲁布斯缓冲溶液和牛血清白蛋白液混合后用荧光分光光度法检测荧光强度，当克拉克鲁布斯缓冲溶液的pH值为6.83时，碲化镉/硫化镉量子点QDs对牛血清白蛋白有很高的选择性信号，且可以获得最大荧光强度。这种方法为纳米材料在化学分析和生物化学分析及定量定性检测中的应用开辟了道路。

6 展望

随着纳米科学技术的发展和量子点标记技术的日臻完善，量子点在生物医学方面的应用显示了巨大的学术价值和良好的商业前景。但量子点的应用远不止于此，在光学、电子学、信息科学、药学等研究领域里均得到了广泛的研究。量子点在生物医学中的应用是一个发展前景十分广阔的研究领域。它在生物大分子的定位、功能、相互作用及运动轨迹、定量和成像监测等方面均得到了广泛的应用。将量子点应用于活体内目标生物分子的实时、动态检测目前已成为研究热点。随着研究的不断深入，相信量子点在科学研究中的作用必将会越来越大，必将为人类探索和解决实际问题提供巨大的帮助。

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