细胞永生化技术在体育领域研究的可行性分析

刘 宇，赵玉华

（哈尔滨体育学院，黑龙江 哈尔滨 150008）

细胞永生化技术在体育领域研究的可行性分析

刘 宇，赵玉华

（哈尔滨体育学院，黑龙江 哈尔滨 150008）

目前细胞生物学技术迅猛发展，使优秀运动员细胞“永生化”成为可能。这在根本上解决了寻找抑制人类运动能力基因研究的接力式进行和标本的暂时性的采集中存在的矛盾，介绍永生化技术在体育研究中的进展，旨为在寻找和提高影响人类运动能力基因方面提供可行性的研究方法。

永生化；细胞；体育

Abstract: Techniques of cell biology have been developing rapidly to date, rendering it possible to immortalize athletic cells. In addition, it radically solves the conflict between the intermittent search of determinant genes of human athletic potentials and the temporariness of sampling. This research introduces the latest progress of cell line immortalization in sports, serving the purpose of finding applicable investigation method of athletics related genes.

Key words: Immortalization; Cell; Athletics

CLC number: G804.21 Document code: A Article ID: 1008-2808(2011)01-0083-04

正常组织来源的体细胞在通常的体外培养条件下可生长和分裂,但经过有限次的细胞传代后,就会停止增殖,发生衰老和死亡。而生殖细胞、(胚胎)干细胞、部分肿瘤细胞和外源性基因转染而构建的永生化细胞则具有无限分裂和增殖的能力,是永生化细胞［1］。而能得到越秀运动员的永生化细胞，就为我们研究人类自身限制运动能力基因的连续性，提供了便利的条件。

1 永生细胞的机制

1.1 细胞的衰老

细胞经多次分裂后,在肿瘤抑制因子p53和Rb作用下,细胞对生长因子等失去反应,产生DNA合成蛋白抑制因子,当DNA不能完成修复时，细胞不可逆地停滞于G1期,发生衰老(senescence,M1期)。直到DNA完成修复，阻抑停止，细胞进入S期；如果DNA损伤不能得到有效修复，则p53可能诱导编程性死亡。细胞再经过20～30群体倍增次数(population doublings，PDs)后，进入危机期(crisis,M2期),细胞出现退化,凋亡或者死亡。只有少数细胞在一定因素的影响下，端粒酶被激活，以自身RNA为模板合成端粒DNA来补充或延长端粒，恢复染色体的稳定性，从而使细胞越过危机期，发生了永生化［1-4］。

1.2 细胞永生化

一般认为永生化是体外培养细胞经过自发的或外界因素的影响而从增殖危机中逃逸,从而具有无限增殖能力的过程。基本原理是通过基因转染技等技术，将外源性的永生相关基因转入体外培养的目的细胞，或诱导衰老相关基因突变，以增加永生化的发生概率。被普遍接受的永生化机理是M1-M2理论:细胞经多次分裂后,在肿瘤抑制因子p53和Rb作用下,细胞进入M1期,开始衰老,但不一定死亡。而病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等则可以抑制M1期机制,细胞绕过M1期继续生长。细胞经过20～30次的群体倍增后,进入M2期,细胞出现退化,绝大多数细胞发生凋亡,只有罕见的细胞在一些因素影响下,端粒酶被激活,以它自身RNA为模板不断合成端粒DNA来补充和延长端粒有限长度,以维持端粒长度,恢复染色体的稳定性使细胞得以逾越M2期,获得无限分裂和增殖的能力,细胞发生永生化［5］。细胞自发性永生化的几率非常小,啮齿类动物细胞为10-5～ 10-6,而人类细胞则更罕见,小于10-12［6］。因此,保存优秀运动员细胞，寻找影响人类运动能力基因就有必要借助细胞永生化技术。学者们通过基因转染等技术将外源性永生化基因转入目的细胞内,以增加永生化的发生几率,进而建立永生化细胞系。

2 细胞永生化技术的应用

细胞永生化技术发展到今天已有了长足的进步，EB病毒、SV40病毒都是永生化细胞常用的转化病毒，而如乳头瘤病毒E6、乙型肝炎病毒(HBV) 虽不是使细胞永生的常用病毒,但它们可以使一些特殊细胞的增殖能力加强。

2.1 细胞永生化技术在医学遗传领域的应用

杨静［7］等借助EB病毒和TPA的体外协同作用，采用相差显微摄影、间接免疫荧光等方法对12例EB病毒感染的原代人胚鼻咽上皮细胞生长过程进行了观察，针对我国南方地区高发的恶性肿瘤，鼻咽癌，建立了一个良好的体外多阶段细胞模型，为能彻底阐明鼻咽癌发病的分子机制打下基础。潘小平［8］等指出肝组织细胞永生化技术不仅能为肝组织细胞生物学的研究提供性状稳定的研究对象,还为生物型人工肝、细胞移植等研究提供了一种可靠的潜在细胞源。柯朝阳［9］等应用含有HPV16 DNA的质粒转染正常人喉上皮细胞,试图建立永生化人喉上皮细胞系并确证HPV与喉癌的发生有无因果关系。其永生化细胞人喉上皮细胞系的建立为研究人口腔、食管、支气管、子宫颈等部位肿瘤提供了良好的体外模型。褚嘉祐［10］等承担中国不同民族基因组的保存与遗传多样性研究，中国不同民族永生细胞库系统地收集了中国42个民族的58个群体的血样标本，建立了包含3119株永生细胞株库和6010余例个体的DNA库，永久性保存，解决中华民族基因组保存问题，供今后永久性研究。在中华民族基因组保存和遗传多样性研究的基础上，涉及疾病，特别是不同群体发病率有较大差异的疾病基因研究将可能得到突破。

2.2 可应用于体育的永生化技术

在众多转化体外细胞使其永生化的方法中，我们常以采集样本方便，病毒转化永生化细胞率高，操作周期短的EB病毒转化外周血B淋巴细胞建立永生细胞系［11］，为保存优秀运动员基因，研究影响运动能力基因的最合适方法。

EB病毒是爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr）的简称。是在非洲伯基特淋巴瘤中发现的一种疱疹病毒，属疱疹病毒科。EB病毒具有嗜B淋巴细胞的特性，可以在体外直接感染人类外周血淋巴细胞，刺激多克隆免疫球蛋白分泌。在大多数实验室,B95-8细胞系已成为EB病毒的主要来源。人类和部分灵长类动物的成熟B淋巴细胞上具有EB病毒的受体，所以为EB病毒感染B淋巴细胞已达到无限生殖提供条件。有关EB病毒转化B淋巴细胞的机制研究认为,EB病毒首先通过病毒外膜蛋白gp350/220与B淋巴细胞表面补体C3d的受体CR2（complement receptor type 2,CR2）结合,由于CR2是补体激活调节剂家族中唯一能在成熟的B淋巴细胞上表达的成员，所以表达CR2的B淋巴细胞，EB病毒通过受体介导的细胞内吞作用进入其内部。EB病毒内嵌进入细胞后，形成一个蛋白覆盖的液泡，不需要溶酶体的作用，病毒可自行脱包膜，伺候EB病毒核衣壳体直接与液泡膜融合进入胞质、胞核［12］。进入宿主细胞后，EB病毒脱去衣壳，末端重复序列融合，病毒基因组环化以多拷贝型质粒的形式保存。病毒基因组编码的EBNALP、1、2、3A、3C和LMP1对维持细胞的转化是必需的,其中EBNA2、3C和LMP1直接诱导B淋巴细胞在正常活化途径中所需基因的表达［13-16］。EB病毒永生化的B细胞的一个最显著的特点就是端粒酶活性的提高,这可能是导致B细胞永生的主要原因。EB病毒转化外周血B淋巴细胞,使其成为一种能连续分裂永久生存的类淋巴母细胞,由此建立的类淋巴母细胞株即为永生细胞株, 其端粒酶活性提高，维护了细胞染色体端粒长度的稳定，并能够不断分裂增殖，从而促使B淋巴细胞的永生性生长，它可永远的进行传代,并且每一种永生细胞株保存了原来提供血样个体的完整基因组,而且它的生化和分子生物学特性不发生变化［17-20］，所以可作为优秀运动员基因库建立的首选方法。

运用细胞永生化技术建立运动员基因库鲜有报道，但我国优秀运动员的基因库建设已开始进行。2006年，由上海市科委资助，上海体育科研所承担的“上海优秀运动员基因库的初步建立及身体素质相关基因的研究”课题结题，建立起上海及中国部分重点耐力性项目优秀运动员基因库［21］。2007年，台湾体育学院的一个研究团队建立“运动高手基因库”，其中包括跆拳道，棒球两个项目的优秀运动员，用唾液采样的方式取得杰出运动员的基因，进一步分析其特殊基因模式，并认为日后可作为选才的依据［22］。2008年“国家计划生育委员会科学技术研究所”里，建立了由中国科学家独立操作的“中国人遗传资源库”，其中共有20个资源类型，已经采集24万份生物信息样本。比起“肿瘤”、“人体组织器官”这样的资源库，“优秀运动员”的资源库很小，目前只有血液样本390份。但这个资源库却因为已经采集了刘翔、姚明这样著名的运动员的遗传信息而备受关注［23］。目前湖南等几家地方体科所正联合北京体育大学，筹建优秀举重运动员基因库，龙清泉等国际健将都将列入研究对象［24］。

3 细胞永生化技术在体育中的应用前景

EB病毒转化优秀运动员外周血B淋巴细胞建立的永生细胞株让原本有一定寿命的人体细胞能够不间断地繁殖下去，使各个领域优秀运动员的基因得以永久的保存。永生细胞株的建立不但能够永久保存相关个体的基因，而且由于可以为研究各运动项群基因结构差别、探讨各运动项群的共同点及之间差别、探索重要抑制运动能力基因在各运动项群中分布特征及遗传学意义、建立一系列与耐力、力量、速度性相关的项群体系细胞库、基因探针、基因兴奋剂等诸多体育科研领域提供源源不断的细胞和DNA，所以在体育科学研究中建立优秀运动员的永生细胞库必将得到越来越多的重视。永生细胞株在转化前后其细胞和分子遗传学是稳定的，但细胞株在长期传代的过程中遗传特征是否发生改变，是一个关系着科学研究中实验结果准确性的重要问题，也是我们继续研究的方向［25］。

4 结束语

寻找影响和限制人类运动能力的基因需要长时间的探索与研究。但是，在传统的方法中，研究的接力式进行和标本的暂时性的采集中存在的矛盾很难调和，所以将优秀运动员的基因进行细胞永生化，可有效的对同一研究对象进行持久的连续性的研究。细胞永生化技术这不仅仅将运动遗传资源得到有效地保存，也是为进一步影响运动能力基因的寻找与开发提供了物质基础，更是为青少年儿童的运动选材、优秀运动员及后备人才的选拔提供了现实依据。

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The Feasibility Analysis of Cell Line Immortalization in Athletics

LIU Yu, ZHAO Yu-hua
(Harbin Institute of Physical Education, Harbin 150008, HeilongJiang China)

G804.21

A

1008-2808(2011)01-0083-04

2010-08-29；

2010-09-26

刘 宇（1985－），男，在读硕士研究生，研究方向为体育运动中竞技能力的开发与评定。