多胚亚麻的胚珠整体透明与解剖观察

康庆华 ，徐 涵 ，关凤芝 ，吴广文 ，孙中义 ，黄文功 ，程莉莉 ，姜卫东 ，赵东升 ，刘 岩 ，吴建忠 ，宋喜霞 ，余 莹

（1.黑龙江省农业科学院经济作物研究所哈尔滨150086；2.法国图卢兹综合科学研究所（IRIT-ARI）法国，图卢兹31300；3.黑龙江省农业科学院畜牧研究所哈尔滨150086）

栽培种亚麻（Linum usitatissimum L.），简称亚麻，属亚麻科、亚麻属（Linum）[1]，该种内极少部分种质存在多胚性，即在一个胚珠内存在两个或两个以上胚胎。在多胚中，附加胚大多由植物无融合生殖产生，从多胚苗中可能筛选获得单倍体，所以多胚亚麻的利用成为当今亚麻育种的一个新方向。多胚亚麻的胚胎学研究是多胚种质利用的基础，但至今其细胞学机制未能明确。因此进行亚麻多胚胚胎发生及发生方式的研究是十分必要的。

植物幼胚被多层胚珠组织包裹，通常采用切片、人工分离(酶法或手工分离)、整体-透明等方法观察。其中整体透明技术是观察植物幼胚最快捷、最简单的方法。植物胚珠的整体透明技术最初由Herr(1971)提出，但Herr的方法需要使用相差和干涉显微镜[2]。在此基础上，Crane(1978)使用冬青油(水杨酸甲酯，methyl salicylate)作为透明剂对整体透明技术进行了改进，用于观察整体胚珠中的胚囊，效果良好[3]。后来，杨弘远使用爱氏苏木精(Ehrlich’s hematoxylin)染色-冬青油透明技术进一步完善了整体染色与透明技术[4][5][6]，但该技术制片时间长（至少需要2 d）而且所使用的透明剂冬青油具有毒性[7]。由于本试验所要进行的是在大量胚珠筛选多胚并对双胚的发生及发生方式进行观察，需要达到量化的、3D数据采集目的，所以进行了改进，获得了快速、低毒、易于解剖和观察的较好效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用的亚麻幼嫩果序于2010年7月上旬采自黑龙江省农业科学院经济作物研究所哈尔滨市试验区。该试验材料组合号H04052，为多胚诱导杂交组合的后代。采集后直接用于试验。

1.2 试验方法

固定：果序取回后，在卡诺固定液常温固定24小时后放于75%的酒精中保存。

水合：用50%、25%、0%的酒精溶液冲洗。

解离：从果序上摘下蒴果，分三类：受精1～3d的为一类，放入同一三角瓶内，受精4～6d的为一类，受精7d以上的为一类。加入1M氢氧化钠溶液60°C下处理10～30min。冷却后用清水冲洗。

透明：剖开蒴果取出受精后的胚珠放入10%次氯酸钠溶液中浸透（真空）2h。

解剖观察：取已透明的胚珠用水冲洗后，放在培养皿或载玻片上，在Leica倒置荧光显微镜下观察、解剖并显微摄像。

2 结果与分析

2.1 亚麻的子房结构观察

将亚麻受精后的子房剖开后，可见5个子房室(幼嫩果室)，每个子房室内有2个胚珠。一般1个胚珠发育成1个正常的幼嫩种子。

2.2 亚麻受精胚珠的透明效果

已透明的胚珠用清水冲洗后，胚珠内的幼胚轮廓已明显可见(图1～3)。

2.3 胚珠内幼胚的观察与解剖

压片后在显微镜下可观察到的幼胚。受精4～6d的胚珠透明效果最好，容易完整解剖出幼胚(图4～6)。

2.4 多胚发生率

整体解剖50个胚珠，其中有20个没有胚胎（原因可能是授粉不良所致）；26个具有正常的单个合子胚；4个具有双胚。双胚发生率为8%。

2.5 多胚排列方式

所观察到的4个多胚胚珠都是双胚（图7～9），胚胎在胚乳中生长。其中，有1个着生位置不能确定，1对双胚疑似2个胚纵向罗列，另外两个胚珠的双胚都是纵向罗列。这些双胚都是小的胚靠近珠孔端生长，而较大的胚在合点端生长。

图1 ～3.已透明的部分胚珠 图4～6.剥离出的亚麻幼胚 图7～9.剥离出的多胚亚麻双胚显微镜下观察到的多胚性亚麻种质的幼胚Fig.1 ～3 Parts of cleared flax ovules Fig.4～6 Isolated young embryos Fig.7～9 Isolted twin embryos of polyembryonic flax and young embryos observed under binocular microscopy

3 问题与讨论

利用该技术对多胚受精后的胚珠进行整体透明并解剖，方法简单，可节省染色和透明时间，并且能取得较好的观察和采集3D数据的效果。通常，10%的次氯酸钠溶液应用为漂洗液或消毒液，本试验做为透明剂使用，与冬青油、丁香油、油镜油等透明剂相比具有价格便宜、容易购买等优点，并具有良好改变材料的透光性能。

在本试验中，利用10%的次氯酸钠溶液透明时，应将浸透种子的容器抽成真空，才能完全除去胚珠内的气泡，否则胚珠内层的气泡将使透明剂无法快速对胚珠进行浸润、透明，在显微镜下出现不透明的黑色斑点，不能获得较好的透明和观察效果。本试验利用该技术虽然对观察和解剖多胚亚麻的胚珠取得了较好的效果，但也存在一定的缺点：当对试验中所剥离到的双胚进行DAPI以观察染色体时，没有获得理想的染色效果。原因可能是DNA被强碱等水解。

多胚亚麻的幼胚显微镜下观察的结果表明，受精7d以内的胚珠透明效果较好，受精8d以上的胚珠应增加碱解时间和透明时间；受精1～3d的胚珠很难剥离到幼胚；受精4～6天的胚珠是观察和剥离幼胚最佳时期。

在以往的多胚材料发芽试验中发现双胚种子的两条胚根可以从种子的不同部位发生，认为双胚在胚珠中可能存在多种排列方式。但本试验在同一胚囊内所观察和解剖到的双胚都呈纵向罗列方式，小胚靠近珠孔端生长，较大的胚在合点端生长。至于是否存在横向或纵向并列等方式排列有待进一步探讨。本试验未观察到三胚、四胚胚珠。

[1]王玉富，粟建光，等.亚麻种质资源描述规范和数据标准[M].北京:中国农业出版社,2006.

[2]J.M.Herr,Jr.,A New Clearing-Squash Technique for the Study of Ovule Development in Angiosperms[J].American Journal of Botany,1971,58(8):785-790.

[3]Crane.C.F.,Apomixis and crossing incompatibilities in some Zephyrantheae.Ph.D.Thesis,University of Texas,Austin,TX,1978.

[4]杨弘远.用整体染色与透明技术观察胚囊、胚、胚乳和胚状体[J].植物学报,1986,28(6):572-581.

[5]杨弘远.植物胚胎学中的整体透明技术[J].植物学报,1988,30(2):114-116.

[6]杨弘远,周嫦.植物有性生殖实验研究四十年[M].武汉:武汉大学出版社,2001.

[7]李正理.植物制片技术[M]..北京:科学出版社,1987.