抗草甘膦杂草及其检测方法发展现状

陈景超， 张朝贤， 黄红娟， 魏守辉

（中国农业科学院植物保护研究所，中国农业科学院杂草鼠害生物学与治理重点开放实验室，北京 100193）

草甘膦是一种内吸传导型广谱灭生性除草剂，由美国孟山都公司于1971年研制成功，可以防除一年生和多年生杂草。由于其杀草谱广，低毒、低残留，在世界范围内广泛使用。转基因作物自1996年推广以来，得到快速发展，到2010年全球转基因农作物种植面积达到1．48亿h m2，15年种植面积增长了87倍。其中耐除草剂转基因作物种植面积占60%以上，而耐草甘膦转基因作物种植面积占到耐除草剂转基因作物的95%以上［1］。

我国是草甘膦生产大国，其中80%用于出口，2010年我国草甘膦出口总量为519 943 t，比2009年增长1．9%［2］。我国也是草甘膦应用大国，1973年我国开始进行草甘膦药效试验，起初主要应用于果园，后来随着少耕免耕等耕作方式以及作物行间定向保护性喷雾技术的发展［3］，草甘膦在我国需求量越来越大。耐草甘膦转基因作物的种植，不仅能减少除草开支，还能缓解我国大豆等一些重要粮食长期依赖进口而被国外企业操控的局面［4］。

草甘膦的长期、单一使用也产生了诸多严重问题：一些对草甘膦不敏感的杂草，转变为危害作物的主要杂草［5－6］；草甘膦的长期使用还会影响土壤微生物［7］，加大大豆根部病害几率［8］；而最为严重的是抗草甘膦杂草的出现，从20世纪90年代开始，抗草甘膦杂草不断涌现，造成了重大经济损失。因此，掌握科学快速检测抗性杂草的方法以便及时采取措施非常重要。

本文介绍了抗草甘膦杂草的发生、发展现状，以及检测方法的发展，为我国抗草甘膦杂草的检测与监测提供一定依据，为抗草甘膦作物的安全生产提供科学保障。

1 抗草甘膦杂草发展现状

1．1 草甘膦作用机理

草甘膦通过竞争性抑制莽草酸途径中的5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸合成酶（5－enolpyr uvylshiki mate－3－phosphate synt hase，EPSPS，EC 2．5．1．19），使磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyr urate，PEP）与莽草酸－3－磷酸（shiki mate－3－phosphate，S3P）合成5－烯醇式丙酮酸－3－磷酸莽草酸（5－enolpyr uvylshikimate－3－phosphate，EPSP）过程受阻，导致芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的合成阻断而引起植物死亡［9］。

1．2 抗草甘膦杂草的发展

由于草甘膦与EPSPS具有多结合位点、在环境中残留量低等特点，人们一直认为杂草对其产生抗药性的几率极低［10］。然而，1996年，第1种抗草甘膦杂草硬直黑麦草（Loliu m rigidu m）在澳大利亚发现，其对草甘膦的抗性达到11倍［11］，杂草对草甘膦不易产生抗药性的说法被打破。随着耐草甘膦转基因作物种植面积的不断扩大，草甘膦的用量越来越大。这种简便的除草方式虽然给人类带来了巨大的经济效益，但也使得抗草甘膦杂草不断出现。截至2010年，全球14个国家和地区发现了21种抗草甘膦杂草［12］。

从1997年到2002年抗草甘膦杂草新种类的发展并不十分严重，6年时间只发现了牛筋草（Eleusine indica）［13］、多 花 黑 麦 草 （Loliu m multif lor u m）［14］、小白酒草（Conyza canadensis）［15］3种杂草对草甘膦产生了抗性。但从2003年开始，抗草甘膦杂草的种类每年都以2～3种的速度迅速增长，截至2010年，8年时间其种类增加了17个。

抗草甘膦杂草种类增加越来越快，对于抗药性杂草抗性机理的研究也成为热点，但是目前有些杂草的抗草甘膦机制还并不明确。不仅如此，如表1所示，一些在世界范围内分布较广的杂草，出现在多国产生抗性的现象，如香丝草（Conyza bonariensis）、小白酒草、多花黑麦草、黑麦草（L．perenne）、硬直黑麦草等。

表1 抗草甘膦杂草分布及抗性机制

2 抗草甘膦杂草检测方法研究现状

2．1 整株水平测定

2．1．1 整株植物测定法

整株植物测定法简单易行，重复性好，是检测杂草对除草剂是否产生抗性最为普遍的方法［16］。将疑似对草甘膦产生抗性的杂草种子盆栽，在温室设置适宜杂草生长的条件培养。禾本科杂草一般培养到3叶期，阔叶及莎草科杂草根据杂草本身条件而定，培养到适合称取生物量为宜。设置不同剂量处理杂草，草甘膦剂量不少于7个，2～3周后称其鲜重、干重等指标，运用回归模型计算出抗药性水平［17］。整株植物法由于准确度高而被广泛用于检测杂草对草甘膦抗药性，目前发现的每种抗草甘膦杂草都用过此种方法，但此法需要较长的时间，并要求足够量的重复以确保结果的准确性。

2．1．2 培养皿检测法

培养皿法较整株植物测定法快速、简便。已经成功应用于检测杂草对除草剂的抗药性［18－20］。在培养皿中加入滤纸，将不同浓度梯度草甘膦加入培养皿，草甘膦剂量一般设置6个，药剂均匀浸湿滤纸，再将杂草种子放入培养皿，在培养箱中培养10 d左右，通过测定发芽率、根长等指标，计算其抗性水平。Perez利用培养皿法成功检测了智利果园多花黑麦草对草甘膦的抗药性水平［14］。Leonardo也利用这种方法成功检测出巴西的马唐（Digitaria insul aris）对草甘膦产生了抗药性［21］。

由于不同杂草的种子大小、发芽特性不同，该方法的应用有一定局限性。一般应用于禾本科杂草对除草剂的抗药性检测。培养皿法检测抗药性的准确性较差，用此种方法测得的杂草对草甘膦的抗药性水平一般高于整株植物法［22］。

2．1．3 症状指数法

草甘膦处理杂草后，会表现出褪色、黄化、叶片卷曲等症状，按照症状严重程度将其分为6个级别（表2）。将杂草种子盆栽培养到一定生长阶段，用不同浓度梯度草甘膦处理，当不同处理杂草表现出的症状差异明显时记录其症状级别。利用曲线回归模型计算GR50，确定杂草对草甘膦的抗性水平。吴加军等用此方法测定了我国小白酒草对草甘膦的敏感程度［23］，重复性较好。症状指数法也有局限性，由于症状级别无明显界限而且各种杂草受草甘膦处理后表现出的症状也有差别，因此划分症状级别时有一定主观性。

表2 杂草症状分级标准

2．2 生物化学测定法

2．2．1 莽草酸法

草甘膦处理植株后，会引起敏感植株体内莽草酸大量积累［9］，而耐草甘膦转基因作物［24］与抗草甘膦杂草体内莽草酸的积累量则明显低于敏感植株［25］。Tor ben发现草甘膦处理的油菜体内莽草酸的积累量与草甘膦剂量成正比关系，并用Logistic模型算出了草甘膦对油菜的GR50［26］。Dale也尝试将不同剂量草甘膦处理杂草，从杂草叶片中检测莽草酸含量，并算得几种杂草对草甘膦的GR50［27］。莽草酸法在草甘膦喷药后几天便会检测出结果，而且不需要大量的重复。Perez－Jones利用莽草酸法成功检测出美国俄勒冈州抗草甘膦的多花黑麦草［28］。

2．2．2 其他检测方法

5－烯醇丙酮莽草酸－3－磷酸合成酶（EPSPS）是草甘膦的靶标酶，硬直黑麦草等部分抗性杂草体内EPSPS在草甘膦处理之后活性增高［29］，这种方法检测草甘膦抗性较为快速，但需要精密的仪器，较多的费用，因此不利于在抗性杂草发生地快速检测，而且并不是所有的抗性杂草在草甘膦处理后EPSPS活性都增加，因此只适合于部分杂草的检测。

检测靶标酶基因是否发生突变也可确认杂草对草甘膦的抗性，基因突变使得EPSPS的结构发生变化，从而使其与底物的亲和力增加，杂草因此形成对草甘膦的抗性［30］。由于不同抗性杂草EPSPS基因突变位点不同［31－32］，需要明确各种抗性杂草抗性突变位点才能充分利用分子生物学法检测杂草对草甘膦的抗性。

3 结束语

耐草甘膦农作物的发展增加了农产品的产量，降低了管理成本，其发展势头强劲。但随之带来的抗性问题也需要引起重视。

值得注意的是，在已发现的抗草甘膦杂草中，马唐、牛筋草是我国大豆等作物田常见杂草；小白酒草、香丝草、地肤（Kochia scoparia）等杂草在我国果园等分布广泛。2006年，宋小玲等在我国浙江宁波发现抗草甘膦的小白酒草［33］。如果将来耐草甘膦农作物在我国推广，发展系统检测抗草甘膦杂草的方法十分重要。

目前，我国关于草甘膦抗性杂草及其检测方法的研究较少，正处于起步阶段。培养皿法、症状指数法检测杂草对草甘膦敏感性快速简便，但能否应用于各种杂草也需要进行深入研究。莽草酸法在检测耐草甘膦作物如大豆、油菜对草甘膦敏感性上取得成功，但是莽草酸在各种杂草体内的积累是否都与草甘膦剂量有正相关关系还没有研究报道，因此这种方法对各种杂草抗性检测的适用性还需进一步研究。

有研究表明，草甘膦能对植物叶片叶绿素指数产生影响，而且与草甘膦剂量有一定关系［34］；植物体内的一些物质如苯丙氨酸解氨酶活性会因为草甘膦的处理而降低［35］。因此，也可以从这些方面进行研究，发展完善抗草甘膦杂草的检测方法。

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