HPLC法测定试制卷烟及烟气中6种中草药活性成分的转移率

刘 璐，赵 瑜，贺冬秀，谭新良，陈 波,杨华武

(1.湖南师范大学化学生物学及中药分析省部共建教育部重点实验室，中国 长沙 410081；2.湖南中烟工业有限责任公司技术研发中心，中国 长沙 410007)

烟草属于茄科烟属，是一种重要的经济作物．烟草中含有2000多种化学物质，燃烧后产生的烟气中更含多达5000种物质，其中有大量对人体有害成分，如：尼古丁、焦油和烟碱等．吸食后会对人体器官如心脏、肺等产生不良后果．为减少卷烟中有害成分对人体相关损伤，烟草行业有部分企业尝试将一些对人体有益的中草药活性成分加入卷烟中，如：广西中烟工业公司技术中心将罗汉果苷作为烟用添加剂来增加卷烟香气量，降低烟气干燥感[1]．目前，香烟及其燃烧后的烟气中成分的检验通常采用气相色谱法(GC)[2]、高效液相色谱法(HPLC)[1]、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[3]．其中高效液相色谱法是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的，具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点，应用十分广泛．湖南中烟工业有限责任公司在卷烟中中草药成分添加方面进行了大量探索工作．其中，将试制卷烟(该试制卷烟经过毒理学和临床实验证实可以缓解吸烟所致呼吸道疾病)中添加岩白菜素、黄芩苷、甘草苷等具有镇咳祛痰、消炎降压功效的中草药活性成分．测定这6种成分在烟丝向其燃烧烟气中的转移率，检验燃吸过程中这些中草药提取物的有效成分是否转移到烟气中，提供添加草本中药提取物卷烟中的有效成分向烟气中转移的证据，并能对此类特制香烟的功效进行初步评估．当前的相关报道只对岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和罗汉果苷中一种或者两种成份[4-13]进行检测，尚未见卷烟中此六种物质HPLC法同时检测的相关报道．

本文建立了试制卷烟及其主流烟气中这6种成分同时测定的HPLC法．为对此类试制卷烟及其燃烧后的烟气中的中草药活性成分的含量及转移率的测定及其功效初步评估提供了方法基础．

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

SPD-20A高效液相色谱系统(日本岛津)；电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；KQ3200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；离心机；粉碎机，快速涡旋仪．

甲醇、乙腈色谱纯(美国天地公司)；磷酸，分析纯(湖南师范大学试剂厂)；岩白菜素标准品(纯度>98%)(中国药品生物制品检定局提供)；黄芩苷标准品(纯度>98%)(中国药品生物制品检定局提供)；甘草苷标准品(纯度>98%) (SHANGHAI TAUTO BIOTECH CO LTD (CHINA))；丹皮酚标准品(纯度>98%)和五味子素标准品(纯度>98%)均由中国药品生物制品检定局提供；添加中药成分的试制香烟与剑桥滤片(湖南中烟工业有限责任公司提供)；水为双蒸馏水．

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：HypersilC18-ODS 5 μm(200×4.6 mm)，流动相：A∶B=0.2%磷酸水∶乙腈，梯度洗脱(如表1所示)，检测波长：205 nm，进样量：10 μL，流速：1 mL/min．

1.2.2 标准品配制 单标储备液的配制：分别精密称取适量的岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和罗汉果苷标准品用甲醇溶解，振荡3 min，于5 mL容量瓶中定容，得到这6种待测标准物质浓度分别为790，880，720，3 200，420，660 μg/mL．

混标配制：分别取各单标储备液岩白菜素0.50 mL，黄芩苷0.50 mL，甘草苷0.50 mL，丹皮酚0.125 mL，五味子素0.50 mL，罗汉果苷2 mL于5 mL容量瓶中，用甲醇定容至5 mL．得到混标中各活性物质的浓度分别为：79，88，72，80，42，264 μg/mL．

表1 梯度洗脱表

1.2.3 样品前处理 取三根试制香烟，分别用粉碎机打粉称重，各自溶解于100 mL 50%的甲醇中，放入超声仪中超声提取1 h．测定前用孔径为0.45 μm的尼龙膜过滤．

取空白对照卷烟和加中药提取物的实验卷烟，在标准吸烟条件下分别在吸烟机上吸烟收集粒相成分，每片剑桥滤片各收集20支卷烟的烟气．将剑桥滤片置于50 mL烧杯中，加入50%甲醇水溶液40 mL，超声提取30 min，放冷，离心，上清液转入50 mL容量瓶，用甲醇稀释至刻度，过0.45 μm有机滤膜后进液相色谱分析．

2 结果与讨论

2.1 色谱条件以及提取方法优化

为了获得六种待测物最佳分离图谱，本实验对色谱条件进行了优化．本实验考察了以下几种不同流动相对待测物分离度的影响：甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)，甲醇-水-磷酸(22∶78∶0.1)，乙腈-水(23∶77)，乙腈-水(58∶42)，乙腈-0.2%磷酸水(58∶42)．实验结果表明以上等度洗脱时，六种成分色谱峰分离效果不理想，继续考察了0.2%磷酸水-甲醇，0.2%磷酸水-乙腈的梯度洗脱，发现当A∶B=0.2%磷酸水∶乙腈，进行梯度洗脱时各待测物能获得最佳分离效果．由于甲醇的截止波长为205 nm，乙腈的截止波长为190 nm，而罗汉果苷的最大吸收波长为205 nm，因此，选用乙腈作为流动相的有机相，能获得较好分离效果．各待测物在优化的色谱条件下的色谱图如图1所示，由图1可知各待测物在优化的实验条件下获得好的分离．

实验中选用甲醇-水为样品提取溶剂，同时考察了100%甲醇，50%甲醇，0%甲醇等不同比例甲醇对样品中待测成分的萃取效果，对提取效果进行比较发现：50%甲醇超声提取1 h能获得最佳提取率，

2.2 方法学考察

2.2.1 线性范围及检出限 分别取适量岩白菜素790 μg/mL，黄芩苷880 μg/mL，甘草苷720 μg/mL，丹皮酚3200 μg/mL，五味子素420 μg/mL，罗汉果苷660 μg/mL单标贮备溶液，用50%甲醇稀释摇匀，得一系列浓度的岩白菜素、黄芩苷，甘草苷，丹皮酚，五味子素，罗汉果苷标准溶液．采用峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归分析，得到其线性回归方程，检出限由相应于3倍仪器信/噪比的浓度值计算，结果见表2．

表2 6种物质的回归方程及检出限

2.2.2 精密度 取6种物质低，中，高三种浓度的标准溶液按照1.2实验方法分别进行前处理以及HPLC测定平行测定5次．6种物质日内、日间精密度(RSD)(见表3)分别都小于4.0%和4.1%，表明日内、日间精密度均满足样品分析的要求．

表3 6种物质日内、日间精密度

2.3 加标回收率以及样品分析

取6支已确定岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和罗汉果苷含量的卷烟烟丝，分为6份，1支/份，在每份烟丝中分别添加不同量的岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和罗汉果苷标样，然后采用本方法分别测定其含量，并根据原含量、加标量和测定量计算回收率，结果这6种物质在烟丝中的回收率分别为99.6%，98.5%，98.0%，100.3%，99.5%和97.6%．同样，在已确定烟气滤膜中岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和罗汉果苷含量的滤膜上添加一定量的岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和罗汉果苷标样，采用本方法测定烟气滤膜中其回收率．结果表明这6种活性成分在烟气滤膜中的回收率均在98.0%～100.3% 之间，说明新建方法准确可靠．

运用此方法对试制香烟，烟气滤膜(图1)中岩白菜素、黄芩苷、甘草苷、丹皮酚、五味子素和罗汉果苷的含量进行测定．

(1) 混标色谱图；(2) 试制香烟；(3) 剑桥滤片a.岩白菜素，b.甘草苷，c.罗汉果苷，d.黄芩苷，e.丹皮酚，f.五味子素图1 混合标样及样品色谱图

由谱图可得，这6种活性成分中，除甘草苷，黄芩苷，五味子素外，岩白菜素，丹皮酚及五味子素从香烟烟丝向烟气中有所转移，转移率分别为7.37%，15.26%和9.3%．这是因为岩白菜素，丹皮酚和五味子素的化学性质比较稳定，在烟丝燃烧过程转移到了烟气中，可在抽烟过程中被人体吸入，为特制卷烟中有效添加成分．而甘草苷，黄芩苷和五味子素在香烟点燃过程中由于高温灼烧挥发掉或者生成另外的物质，不能达到预期目的．

3 结论

本文成功地建立了一种准确、快速地同时测定香烟及烟气中的多组分高效液相色谱方法．并用于试制香烟以及烟气中此6种中草药活性成分转移率的测定，结果满意．

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