正交试验优选房陵丹参水溶性成分半仿生-纤维素酶提取工艺Δ

蔡 华，杨光义，叶 方，黄良永，王 刚，郝新才（湖北医药学院附属太和医院，十堰市 442000）

正交试验优选房陵丹参水溶性成分半仿生-纤维素酶提取工艺Δ

蔡 华＊，杨光义#，叶 方，黄良永，王 刚，郝新才（湖北医药学院附属太和医院，十堰市 442000）

目的：优选半仿生-纤维素酶提取法提取房陵丹参水溶性成分最佳工艺条件。方法：以丹酚酸B得率、总酚酸得率和干浸膏收率的综合评分为指标，以酶用量、酶解时间、料液比为考察因素，采用正交试验优选最佳提取工艺。结果：最佳提取工艺为水解酶用量3mg·g-1，酶解时间2h，料液比1∶22。结论：所选工艺合理、可行，可为房陵丹参后续研究提供理论基础。

正交试验；房陵丹参；半仿生-纤维素酶提取法；提取工艺

房陵丹参是湖北省房县产唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。丹参水溶性成分有改善微循环、抑制血小板凝聚、减少心肌损伤及抗氧化等作用。2010年版《中国药典》以丹酚酸B为对照品，用高效液相色谱（HPLC）法对丹参水溶性成分进行含量测定[1]。半仿生提取（SBE）法是在常压、相对温度较高的条件下，以不同pH值的水为溶剂进行连续提取，得到含指标成分较高“活性混合物”的一种新提取方法[2]。近年有学者提出，中药经口给药进入消化道后必须在各种酶的参与下药效成分才能发挥作用，在SBE法基础上，发展了半仿生-纤维素酶提取（SBEE）法，即选择适宜的消化酶对中药进行处理，以破坏其细胞壁，再按SBE法在与人体体温相近的温度下进行提取。该法既避免了高温破坏药效活性成分所致药效降低，又体现了酶在药效成分吸收中的作用，更能体现中药的整体作用[3]。为了对房陵丹参进行SBEE法的系统研究，笔者采用正交试验法，以丹酚酸B得率、总酚酸得率和干浸膏收率的综合评分为指标，优选房陵丹参水溶性成分SBEE提取法最佳工艺条件，以为后续对房陵丹参进行质量控制研究奠定基础。

1 仪器与试药

UltiMateTM3000型HPLC仪，包括四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、chromeleon软件数据处理系统（美国戴安公司）；TU-1901型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；AUW120D型电子天平（日本岛津公司）；CQX25-06型超声波震荡器（上海必能信超声有限公司）；pHS-25型数显pH计（上海精密科学仪器有限公司）。

丹酚酸B对照品（中国药品生物制品检定所，批号：111562-200807）；纤维素酶（酶活力：30U·mg-1，北京索莱宝科技有限公司）；房陵丹参药材采于湖北房县神农本草药业公司房陵丹参GAP基地，由湖北医药学院药学系生药学教研室主任陈吉炎教授鉴定为唇形科植物丹参S.miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎，样品打粉，过3号筛，备用；甲醇、乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 试验设计

根据前期试验，丹参SBEE法最适pH为2.0、7.5、8.0。在饮片规格、溶媒、提取温度、酶解温度、滤过、浓缩等条件相同的前提下，选定水解酶用量（A）、酶解时间（B）和料液比（C）为考察因素，每个因素根据前期试验和参考文献[3]各取3个水平，采用L9（34）正交表进行试验。因素水平见表1。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

2.2 样品溶液的制备

称取丹参药材9份，每份6g，按表2中各条件进行试验，第1次和第3次提取用加热回流法（pH值分别为2.0、8.0；提取时间分别为 1.0、0.5h）；第2次改为加入纤维素酶（pH＝7.5），50℃水浴酶解提取。提取液用4层纱布加100目筛分别滤过，合并滤液，3000r·min-1离心25min，取上清液，浓缩至100mL，制得样品溶液1～9号（每1mL相当于原饮片0.06g）。

2.3 HPLC法测定丹酚酸B含量[1]

2.3.1 色谱条件色谱柱：DiamonsilTMC18（250mm×4.6mm，5μm），前加预柱（10mm×4.6mm）；检测波长：286nm；柱温：30℃；流动相：甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）；流速：1.0mL·min-1；进样量：10μL。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品适量，加75%甲醇制成147μg·mL-1的丹酚酸B对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密量取样品溶液5mL，置于蒸发皿中蒸干，加75%甲醇溶解至具塞锥形瓶中，超声处理（功率：250W，频率：40kHz）30min，放冷，定容至50mL容量瓶中，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，即得供试品溶液（每1mL相当于原饮片0.006g）。

2.3.4 线性关系考察 在上述色谱条件下，取丹酚酸B对照品溶液（147μg·mL-1）分别进样2.0、5.0、10.0、12.5、15.0、20.0μL，测定峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，丹酚酸B进样量（X，μg）为横坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝19.44X－0.2597（r＝0.9998）。结果表明，丹酚酸B进样量在0.294～2.940μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验 取丹酚酸B对照品溶液10μL，按上述色谱条件重复测定6次。结果，RSD＝0.85%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性考察 取同一供试品溶液，按上述色谱条件分别于0、1、2、4、8h进样测定。结果，RSD＝1.49%（n＝5），表明供试品溶液在8h内稳定。

2.3.7 重复性试验 取同一样品，按“2.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下测定。结果，丹酚酸B的平均含量为31.66mg·g-1，RSD＝1.34%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.3.8 加样回收率试验 精密量取1号丹参供试品溶液（156μg·mL-1）9份，每份10mL，分别置于25mL容量瓶中，分成3组，各按80%、100%、120%的比例精密加入丹酚酸B对照品，加75%甲醇定容，摇匀，按上述色谱条件测定，计算加样回收率。结果，平均回收率为98.61%，RSD＝1.98%（n＝9）。

2.3.9 丹酚酸B的含量测定 取供试品溶液及丹酚酸B对照品溶液，在上述色谱条件下分别进样10μL测定，记录丹酚酸B色谱峰面积，以外标一点法计算含量，并按下式计算丹酚酸B得率：丹酚酸B得率＝丹酚酸B含量/0.006×100%。

2.4 分光光度法测定总酚酸含量[4]

2.4.1 对照品溶液的制备 精密量取“2.3.2”项下溶液1.0mL，加75%甲醇定容至10mL量瓶中，即得对照品溶液。

2.4.2 供试品溶液的制备 精密量取“2.3.3”项下溶液2.5mL，加75%甲醇定容至50mL量瓶中，即得供试品溶液。

2.4.3 最大吸收波长的确定 分别取“2.4.1”项下丹酚酸B对照品溶液和“2.4.2”项下供试品溶液，以75%甲醇为空白，在200～500nm波长范围内扫描。结果，对照品溶液和供试品溶液均在285nm波长处有最大吸收，故选择285nm为测定波长。

2.4.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液（14.70μg·mL-1）1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL，分别置于10mL量瓶中，加75%甲醇定容，以相应溶剂为空白，于285nm波长处测定吸光度。以丹酚酸B检测浓度（c，μg·mL-1）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为A＝0.0212c－0.0063（r＝0.9997）。结果表明，丹酚酸B检测浓度在1.47～14.70μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验 取对照品溶液，以溶剂为空白，于285nm波长处测定吸光度，重复6次。结果，RSD＝0.23%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别于0、1、2、4、6h在285nm波长处测定吸光度。结果，RSD＝0.37%（n＝5），表明供试品溶液在6h内稳定。

2.4.7 重复性试验 取同一样品，按“2.4.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，于285nm波长处测定吸光度。结果，丹酚酸B的平均含量70.56mg·g-1，RSD＝0.35%（n＝6），表明方法重复性良好。

2.4.8 加样回收率试验 精密量取“2.4.2”中1号丹参供试品溶液（19.8μg·mL-1）9份，每份5mL，分别置于10mL容量瓶中，分成3组，各按80%、100%、120%的比例精密加入丹酚酸B对照品，加75%甲醇定容，摇匀，于285nm波长处测定吸光度，计算加样回收率。结果，平均回收率为97.36%，RSD＝1.23%（n＝9）。

2.4.9 样品中总酚酸的含量测定 取“2.4.1”、“2.4.2”项下供试品溶液及对照品溶液，于285nm波长处测定吸光度，计算总酚酸含量，并按下式计算总酚酸得率：总酚酸得率＝总酚酸含量/0.0003×100%。

2.5 干浸膏得率的测定

精密量取各样品溶液25mL，置于已烘干至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃烘3h，置于干燥器内30min，称重，并按下式计算干浸膏收率：干浸膏收率＝干浸膏重量/1.5×100%。

2.6 试验结果

以丹酚酸B得率、总酚酸得率、干浸膏收率的综合评分为评价指标。为消除各指标单位和量纲的不同[5]，以及各指标变量范围悬殊所造成的影响，将各指标数据按公式进行标准化处理（式中，X’ij为标准化的值；Xij为样品液i中成分j的含量；Xj为各种样品液i中成分j的平均值；Sj为成分的标准偏差），再根据各指标在工艺选择中的主次，给予不同的加权系数，标准化后的值加权后求和即得综合评分（Y）：Y＝丹酚酸B得率标准化值×6+总酚酸得率标准化值×3+干浸膏收率标准化值×1）。正交试验结果见表2；方差分析结果见表3。

由表2、表3可知，料液比对丹参水溶性成分提取量的影响最大，各因素影响大小次序为C＞B＞A。最佳的提取工艺条件是A2B3C3，即水解酶用量3mg·g-1，酶解时间2h，料液1∶22。

2.7 工艺验证

按优化的SBEE法工艺条件，对房陵丹参进行提取，并按上述方法测定丹酚酸B得率、总酚酸得率和干浸膏收率。结果，各指标值与正交试验结果比较，均处于较高水平，表明优选工艺合理、可行。验证试验结果见表4。

表2 正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal design

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

表4 验证试验结果（n＝3）Tab 4Results of Verification test（n＝3）

3 讨论

植物细胞壁以纤维素为主，加入纤维素酶能使丹参药材细胞壁纤维素的苷键断裂而破碎，有利于内容物的溶出，提高提取效率。通过前期对水加热回流法、SBE法、α-淀粉酶法、纤维素酶法、半仿生-α-淀粉酶法、SBEE法等不同提取方法的比较，发现SBEE法提取效果最好。

纤维素酶的最适pH值为中性偏碱，故本试验选在第2次提取时进行酶解反应，以免在酸性条件下降低酶的活性[6]，使酶解作用达到最佳效果；第1次回流提取使药材细胞壁结构变得疏松，也有利于水解酶充分发挥作用。

丹参水溶性酚酸类成分中丹参素、原儿茶醛[7]与丹酚酸B等均在（280±5）nm波长左右有较强吸收，因此根据吸收值的加和性特点，在285nm波长处测得的吸光度能反应总酚酸多种成分的含量。而丹酚酸B是丹参水溶性酚酸类成分中活性最强、含量最高的成分[8]，以丹酚酸B作为对照品测定总酚酸的吸光度，可以用作总酚酸的含量测定方法，借以考察药材提取方法整体效果，具有科学性和可行性。

房陵丹参中水溶性成分在长时间高温下易分解，SBEE法使用接近体内环境的酶解温度，可防止有效成分分解，提高了提取效率。

纤维素酶使细胞壁分解为易溶解的小分子二聚糖、葡萄糖等，说明酶解法在提高有效成分提取率的同时，其杂质含量可能同样较高，除掉杂质的方法和提取物的药效作用是否优于常规提取法，还有待于进一步研究。

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：70

[2] 张兆旺，孙秀梅.关于中药药剂现代化的思考[J].中成药，2001，23（11）：843.

[3] 宋宏新，刘 静，张彦娟.半仿生酶法提取三七皂苷工艺研究[J].中草药，2009，40（6）：905.

[4] 郑胜国，郭 俊.分光光度法测定注射用丹参川芎嗪中丹参总酚酸的含量[J].中药研究与信息，2005，7（11）：16.

[5] 袁小红.莲子心4种提取方法的比较研究[J].中国药房，2006，17（8）：637.

[6] 王 蕙，付 燕，朗久义，等.酶法及半仿生提取银杏黄酮的工艺研究[J].辽宁中医药大学学报，2009，11（2）：146.

[7] 夏苗芬，周双林.紫外分光光度法测定香丹注射液中水溶性酚和酚酸的总含量[J].科技通报，2004，20（11）：549.

[8] 赵淑娟，章国瑛，刘 涤，等.丹参水溶性酚酸类化合物药理及生物合成途径研究进展[J].中草药，2004，35（3）：341.

Optimization of the Extraction Technology of Semi-bionic Enzyme from Water-soluble Component of Salvia miltiorrhiza of Fangling by Orthogonal Test

CAI Hua，YANG Guang-yi，YE Fang，HUANG Liang-yong，WANG Gang，HAO Xin-cai（Taihe Hospital Affiliated to Hubei Medical University，Shiyan 442000，China）

OBJECTIVE：To optimize the semi-bionic enzyme extraction technology of water-soluble component of Salvia miltiorrhiza of Fangling.METHODS：The extraction technology of S.miltiorrhiza was optimized by orthogonal design using the field of salvianolic acid B，total phenolic acid and dry extract as index and the amount of enzyme，enzymolysis duration and ratio of liquid to material as factors.RESULTS：Optimal extraction condition were as follows：hydrolase of 3mg·g-1，enzymolysis duration of 2h，ratio of liquid to material of 1∶22.CONCLUSION：The optimized extraction condition is reasonable and practical，and provides theoretic basis for further study of S.miltiorrhiza of Fangling.

Orthogonal test；Salvia miltiorrhiza of FangLing；Semi-bionic enzyme extraction；Extraction technology

R284.2；R943

A

1001-0408（2011）03-0222-03

Δ湖北省教育厅高校产学研合作资助项目（CXY2009B040）

＊主管药师。研究方向：医院药学。电话：0719-8801197。E-mail：tsai1094@sina.com

#通讯作者：主管药师，博士。研究方向：中药资源开发和新药研发。电话：0719-8801393。E-mail：ygy996@163.com

2010-04-12

2010-06-28）