一种新型Hsp90抑制剂的合成及其抑制活性*1

张晓颖, 张 杰, 李 伟, 王小龙

(南京中医药大学 药学院,江苏 南京 210029)

热休克蛋白(Hsp)是生物体中普遍存在的高度保守的蛋白质,根据分子量大小可分为五大类:Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60和小Hsp。其中Hsp90和Hsp70与信号分子的关系尤其密切,在细胞恶性转化和转移过程中发挥重要作用[1]。Hsp90是胞质蛋白,在哺乳动物细胞中包括：胞质伴侣(Hsp90α,可诱导型/主要型; Hsp90β,组成型/次要型)，同功异质体内质网伴侣GRP94(葡萄糖相关蛋白94),线粒体同族体Hsp75/TRAP1(肿瘤坏死因子受体相关蛋白1)[2]。Hsp90α在肿瘤细胞中的高表达是许多肿瘤细胞生存的重要条件，因此抑制Hsp90α活性已经成为抗肿瘤的重要靶点[2]。研究表明,许多原癌蛋白都是Hsp90的作用蛋白,如:酪氨酸激酶、丝氨酸/半胱氨酸激酶、缺血诱导因子、端粒酶、突变p53等,这些蛋白酶功能的实现直接依赖于Hsp90的分子伴侣作用。对肿瘤细胞内的Hsp90分子伴侣作用进行抑制,可以间接地同时阻断多种原癌信号通路,从而抑制癌细胞生长、促使癌细胞凋亡。因此,Hsp90已经成为日益引人关注的新型抗癌药物研究的重要作用靶标[3]。

吡唑类化合物是近期报道的一类活性较高的Hsp90抑制剂，基于SNX-2112对HSp90的亲和力与结合方式已有实验确证[4]。本文设计了一条制备Hsp90抑制剂的新合成路线:对氨基苯甲酸在冰浴冷却下生成重氮盐，调节至pH 5后与2-氯乙酰乙酸乙酯反应制得(Z)-4-[2-(1-氯-2-乙氧基-2-羰亚甲基)肼基]苯甲酸(1); 1与二甲基环己二酮成环制得4-[1-(6,6-二甲基-4-氧-3-乙酰氧基-4,5,6,7-四氢吲唑)]苯甲酸(2); 2与对羟基环己胺完成酰胺化反应合成了一种新型Hsp90抑制剂——N-(4-羟基环己基)-4-[1-(6,6-二甲基-4-氧-3-乙酰氧基-4,5,6,7-四氢吲唑)]苯甲酰胺(3, Scheme 1),其结构经1H NMR表征。荧光偏振法研究结果表明3对Hsp90α具有明显的抑制活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

3F-20D型暗箱式紫外分析仪;Bruker Avance Ⅲ 400型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；Mariner 5140型电喷雾质谱仪;Biotech型酶标仪。

柱色谱用硅胶(100目～200目，300目～400目),青岛海洋化工厂;GF254薄层层析硅胶板,烟台德信生物科技有限公司;其余所用试剂均为分析纯,乙醇经镁和碘作无水处理。BPS(分析缓冲液，Hsp90α酶试剂,Cat.No.50298), DTT(二硫苏糖醇,40 mmol·L-1), BSA(牛血清白蛋白,2 mg·mL-1)和二甲亚砜(DMSO),百灵威。1.2 合成

(1) 1的合成

在三颈烧瓶中依次加入水70 mL，无水乙醇10 mL,对氨基苯甲酸2.74 g(20 mmol)和浓盐酸6 mL，搅拌至完全溶解(溶液澄清透明)，置低温恒温反应浴(0 ℃～5 ℃)中,搅拌下分批加入亚硝酸钠1.4 g(20 mmol),加毕，反应30 min(淡黄色澄清透明液体)。用无水乙酸钠调节至pH 5，搅拌下缓慢滴加2-氯乙酰乙酸乙酯2.69 g(20 mmol)的乙醇(20 mL)溶液，滴毕，剧烈搅拌下反应24 h(淡黄色固体)。减压抽滤，滤饼真空干燥后用无水乙醇重结晶得淡黄色针状结晶1 4.21 g，收率77.7%;1H NMRδ: 12.64(s, 1H, CO2H), 10.82(s, 1H, NH), 7.89(d,J=8.7 Hz, 2H, ArH), 7.41(d,J=8.8 Hz, 2H, ArH), 4.29(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 1.29(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3); MS (m+H)/z(%): 271.05(100), 273.04(32), 272.05(11.9)。

(2)2的合成

在三颈烧瓶中依次加入乙醇钠0.68 g(10 mmol)的乙醇(50 mL)溶液,1,3-二甲基环己二酮1.4 g(10 mmol),搅拌使其完全溶解，于室温反应7 h；加入1 2.71 g (10 mmol),于室温反应1 h;于90 ℃反应过夜。用10%盐酸调至pH 7,分液，水层用乙酸乙酯萃取至无色；合并萃取液，浓缩后经硅胶柱层析[梯度洗脱剂:V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=3 ∶1～1 ∶1]分离，用丙酮重结晶得黄色针状结晶24.5 g，收率20%;1H NMRδ: 8.14(d,J=8.4 Hz, 2H, ArH), 7.76(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH), 4.34(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 2.99(s, 2H, CH2), 2.42(s, 2H, CH2), 1.32(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3), 1.04(s, 6H, CH3); MS (m+H)/z(%): 357.17(100), 358.18(20.5)。

(3)3的合成

在反应瓶中加入270 mg,用适量DMF溶解后加入三乙胺50 mg(6 eq),搅拌10 min;加入HBTU(苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐)380 mg(5 eq),搅拌20 min;再加268 mg，于45 ℃反应24 h。浓缩后经硅胶柱色谱层析[洗脱剂:V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶2]分离，用丙酮重结晶得白色或微黄色粉末3,收率70%;1H NMR(CDCl3)δ: 7.92(d,J=8.6 Hz, 2H, ArH), 7.60(d,J=8.5 Hz, 2H, ArH)), 6.07(d,J=7.8 Hz, 1H, NH), 4.49(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 3.99～4.02(m, 1H, CH), 3.85～3.56(m, 1H, CH), 2.83(s, 2H, CH2), 2.50(s, 2H, CH2), 2.12(dd,J=38.9, 11.4 Hz, 4H, CH2), 1.46(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3), 1.32～1.56(m, 4H, CH2), 1.12(s, 6H, CH3)。

1.3 3对Hsp90α的亲合力测定[5]

用荧光偏振法测定3对Hsp90α的亲合力。当荧光素与蛋白结合时相对分子质量变大，旋转速度就会减慢，于是在特定时间内向同一方向发出发射光，荧光偏振值较大。

配制20 mmol·L-13的DMSO溶液(储存液)，用DMSO稀释至c(3)分别为125 μmol·L-1, 25 μmol·L-1, 5 μmol·L-1, 1 μmol·L-1, 0.2 μmol·L-1, 0.04 μmol·L-1, 0.008 μmol·L-1, 0.0016 μmol·L-1。

表 1 反应液组成(以每孔计算)Table 1 Composition of the reaction solution

ac(3)=100 nmol·L-1

各c(3)溶液5 μL加入384孔空白板中，每个c(3)两个重复孔;另加10%DMSO 5 μL作空白对照。在有试液的各孔中加入预先配制的反应液(组成见表1) 45 μL。于室温孵育2 h。在酶标仪上读取数据，记录荧光偏振值(FP)。

2 结果与讨论

采用SPSS 17.0统计分析软件计算3的IC50为657.257(经典HSp90抑制剂geldanamycin的IC50为65.24[5])。c(3)对于荧光偏振值的影响见图1。由图1可见，随着c(3)的降低，荧光偏振值逐渐增高，说明3对Hsp90α有明显的亲和力。Hsp90抑制剂的作用机制是与Hsp90N端的ATP活性中心相结合，从而产生抑制作用。3与Hsp90α的亲和力越高，提示其对该酶的抑制活性越好。

c(3)/×10-9 mol·L-1图 1 c(3)对于荧光偏振值(FP)的影响Figure 1 Effect of c(3) on fluorescence polarization value(FP)

[1] Pratt W B, Toft D O. Regulation of signaling protein function and trafficking by the hsp90/hsp70-based chaperone machinery[J].Exp Biol Med,2003,228:111-133.

[2] 王绯,杨永平. HSP90抑制剂靶向治疗癌症研究进展[J].解放军医学杂志,2006,3(31):274-275.

[3] 李永强,袁霞,周玉美. 热休克蛋白90(Hsp90)抑制剂荧光标记探针化合物的设计合成[J].中国药物化学杂志,2009,6(19):170-180.

[4] Kenneth H Huang, James M, Veal R,etal. Discovery of novel 2-aminobenzamide inhibitors of heat shock protein 90 as potent,selective and orally active antitumor agents[J].J Med Chem,2009,52:4288-4305.

[5] 董飚,陶佩珍,李艳萍. 荧光偏振法建立格尔德霉素-Hsp90α结合高通量筛选模型及其应用[J].中国新药杂志,2011,20(5):447-450.