莪术内生真菌产β-榄香烯代谢产物的研究

宣 群，张玲琪，杨 娟，李玉鹏

1昆明医学院微生物学暨免疫学教研室，昆明650500;2云南大学生命科学学院，昆明650091; 3思茅师范高等专科学校生命科学系，普洱665000;4昆明医学院化学教研室，昆明650500

莪术内生真菌产β-榄香烯代谢产物的研究

宣 群1*，张玲琪2，杨 娟3，李玉鹏4

1昆明医学院微生物学暨免疫学教研室，昆明650500;2云南大学生命科学学院，昆明650091;3思茅师范高等专科学校生命科学系，普洱665000;4昆明医学院化学教研室，昆明650500

从莪术内生真菌常现青霉EF03和巴恩青霉EF11的发酵产物中分离到抗癌药物β-榄香烯。在莪术的微生态系统中，由于内生真菌长期与植物相互作用，可能发生了“基因水平传递”。从而产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物。

莪术内生真菌;次生代谢产物;β-榄香烯

莪术是姜黄属多年生草本植物，是我国传统中药。其根及根状茎产生的抗癌成分β-榄香烯是一种广谱、高选择性的抗癌药物。它不仅可以抑制和治疗癌症，还能有效缓解癌性疼痛;增强T细胞亚群的功能，改善CD+4/CD+8比例失调，促进Th和Tc的作用;以及诱导改变肿瘤细胞膜HSP70蛋白合成及分布，提高肿瘤细胞的免疫原性，抑制肿瘤复发和转移［1］。利用微生物发酵生产药物不受季节气候限制;可用发酵罐大规模重复生产，缩短生产周期，节约土地资源;可以通过育种和控制发酵条件等措施来大幅度提高其有效成分的含量。因此，利用微生物生产药物前景十分广阔。在植物微生态系统中，内生真菌与宿主长期和谐相处，会产生复杂多样的次生代谢产物［2］。1993年，Strobel等从短叶红豆杉(Taxus brevifolia)树皮中分离到一株产紫杉醇的内生真菌［3］。由此开始了利用植物内生真菌发酵生产抗癌活性成分新途径的研究。本研究首次报道，从莪术根和根状茎分别分离到一株产β-榄香烯的内生真菌菌株。

1 仪器与试剂

BRUKER Avance DRX500兆(TMS内标，CDCl3为溶剂)核磁共振仪;GC8000型气相色谱仪;Fisons MD800型质谱仪。GF254薄层层析板购自青岛海洋化工厂。试剂均为国产分析纯。

对照品原料榄香烯注射液购自大连金港制药有限公司。

2 菌种与培养条件

菌种:编号为EF03和EF11的菌株分别从采自云南屏边县新现乡的莪术根和根状茎中分离得到。培养基:改良MM液体培养基。菌种培养:在500 mL的三角瓶中，装入200 mL的改良MM液体培养基。用接种钩挑取少许菌丝接种于培养瓶中，置于28℃摇床(108 r/min)培养8 d。

3 提取与检测

过滤发酵液，把菌丝冷冻研磨，与发酵液合并后用石油醚(30～60℃)萃取;在70℃水浴中蒸馏，分别用展开剂石油醚-乙酸乙酯(99∶1);正已烷-乙醚(93∶7)进行薄层层析。GC8000型气相色谱仪和Fisons MD800型质谱仪检测代谢产物。

4 对照品制备

榄香烯注射液破乳萃取［4］后，按文献制备对照。限于样品量，本工作将柱层析改为薄层层析(TLC)。自制的对照品经NMR检测。

5 结果与讨论

5.1 对照品检测结果

经薄层层析分离，石油醚洗脱，蒸馏并挥散溶剂后，得到较高浓度的某一组分。1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.84(1H，dd，J=17.5，10.95 Hz)，4.92 (2H，dd，J=17.4，10.8 Hz)，4.84(s，2H)，4.73 (2H，d，J=8.4 Hz)，4.61(s，2H)，2.03(m，1H)，1.95(m，1H)，1.77(s，3H)，1.73(q，3H)，1.63(m，1H)，1.56(m，2H)，1.46(m，1H)，1.45(m，2H)，1.02(s，3H);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:150.5，150.5，147.9，112.3，110.0，108.4，52.9，45.9，40.1，39.9，33.1，27.0，24.9，21.2，16.8。以上数据与文献报道一致［5，6］。故确定，对照品中含有高浓度的β-榄香烯。

5.2 TLC检测结果

用毛细管定量吸取对照品、发酵提取物和空白品，分别点样于同一硅胶GF254板上，以不同的展开剂展开10 cm，取出晾干并显色。结果表明，在两种不同的展开剂石油醚-乙酸乙酯和正己烷-乙醚中，EF03和EF11的培养物均含有与对照品迁移率(Rf值)相同的斑点。表明这两株真菌发酵产物中可能含β-榄香烯或其类似物。

5.3 气相色谱/质谱(GC/MS)检测结果

5.3.1 检测条件

GC检测条件为载气(He)，起始温度60℃，保持5 min，以8℃/min升至250℃，保持10 min;MS检测条件为传输线温度250℃，离子源温度200℃，电离电压70 eV。

5.3.2 确定了对照品β-榄香烯的化学结构及出峰的保留时间，并以此为依据检测EF03和EF11的代谢产物。

由图1、图2和图3可见，在上述条件下，样品的分离效果好。根据质谱检测到的特征性碎片峰，确定样品EF03和EF11含有β-榄香烯。其原因可能是内生真菌EF03和EF11在莪术的微生态系统中，长期与植物相互作用，发生了“基因水平传递［7］”，从而产生与宿主植物相同或相似的次生代谢产物。

具有相同次生代谢产物的生物合成途径可能是由于相关基因的直接传递，这种传递可以发生在寄生生物与寄主之间或共生生物之间，经长期直接接触而传递遗传物质。在这一过程中，转座因子的普遍存在及其转座功能可能起了很大作用［7］。真菌产生植物药用成分的代谢机制能促使植物更好地适应其生态环境;同时，内生真菌可能通过产生和耐受植物药用成分以便更好地模拟宿主的化学环境，增强竞争能力，从而有利于真菌的生存与进化。在长期共同生活过程中，内生真菌与宿主植物关系密切。在一定条件下，真菌可刺激植物产生次生代谢产物;宿主也可能将其部分遗传物质或信息传递给真菌，使真菌在一定程度上具有与宿主相同或相似的代谢途径，导致真菌产生某些特定物质。研究者才能从药用植物中筛选出特殊的内生真菌能产生与宿主相同或相似的生理活性成分。

1 Yuan J(袁静)，Wang PQ(王平全).Pharmacology and clinical application of elemene.China Pham(中国药房)，1998，9:230-231.

2 Janice EK.Cooke.From the inside out:fungal endophytegrass associations and grassland communities.New Phytologist，2007，173:667-669.

3 Strobel G，Stierle A，Stierle D，et al.Taxomyces andreanae，a proposed new taxon for a bulbilliferous hyphomycete associated with pacific yew(Taxus brevifolia).Mycotaxon，1993，47: 71-80.

4 Xie JH(谢继红)，Hou LJ(侯丽娟)，Wang Y(王瑜).The Quality standard of elemene.Chin Tradit Herb Drugs(中草药)，2001，32:419-420.

5 Kim D，Lee J，Chang J，et al.Stereoselective synthesis of (±)-β-elemene by a doubly diasterodifferentiating internal alkylation:a remarkable difference in the rate of enolization between syn and anti esters.Tetrahedron，2001，57:1247-1252.

6Guo YT(郭永沺)，Wu XY(吴秀英)，Chen YR(陈玉仁).Isolating and identifying of elemene from the naphtha of Curcuma wenyujin.Bull Chin Mater Med(中药通报)，1983，8 (3):31.

7 Pennisi E.Is it time to uproot the tree of life?Science，1999，284:1305-1307.

β-Elemene from Curcuma zedoaria Endophytic Fungus

XUAN Qun1*，ZHANG Ling-qi2，YANG Juan3，LI Yu-peng41The Department of Microbiology and Immunology，Kunming Medical University，Kunming 650500，China;2School of Life Science，Yunnan University，Kunming，Yunnan，650091，China;3The Department of Life Science，Simao Teachers College，Puer 665000，China;4The Department of Chemistry，Kunming Medical University，Kunming 650500，China

β-Elemene was found in the metabolites of endophytic fungi，Penicillium frequentans(EF03)and P.baarnense (EF11)，which isolated from Curcuma zedoaria.In the microecosystem of Curcuma zedoaria，gene horizontal transmission may take place due to interaction of endophytic fungi and the plant for a long time.So endophytic fungi gave rise to the same secondary metabolites as their host.

endophytic fungi of Curcuma zedoaria;secondary metabolite;β-Elemene

1001-6880(2011)03-0473-03

2009-10-09 接受日期:2009-12-09

国家自然科学基金(39860005);云南省教育厅自然科学基金(06Y043C)

*通讯作者 Tel:871-5922857;E-mail:xuanqun650033@sina.com

Q939.92

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