树形分子修饰的碳纳米管颗粒转染胰腺癌细胞BxPC3安全性的研究

程东峰 吴旭波 王加祥 韩宝三 张雪清 杨浩 袁恒光 朱萍 彭承宏

·论著·

树形分子修饰的碳纳米管颗粒转染胰腺癌细胞BxPC3安全性的研究

程东峰 吴旭波 王加祥 韩宝三 张雪清 杨浩 袁恒光 朱萍 彭承宏

目的观察单壁碳纳米管-聚酰胺树形分子复合物(CNT-PAMAM-D)进入胰腺癌细胞的过程，评价其作为载体的安全性。方法通过超声、搅拌及洗涤等方法制备CNT-PAMAM-D，用原子力显微镜和透射电镜观察其形态。将CNT-PAMAM-D与人胰腺癌细胞BxPC3共同培养12、48、72 h，收集细胞，在透射电镜下观察细胞内CNT-PAMAM-D的分布及细胞超微结构的改变。结果PAMAM-D与CNT结合之后，树形分子包裹在CNT的表面，形成了20 nm左右大小的纳米复合物颗粒。CNT-PAMAM-D通过细胞吞饮方式被吞入BxPC3细胞，12 h后即大量进入细胞质内，随着时间延长，CNT-PAMAM-D还可进入溶酶体及细胞核中，但胰腺癌细胞的形态及超微结构无显著变化。结论CNT-PAMAM-D是一种高效、安全的纳米载体。

胰腺肿瘤； 碳纳米管； 树形分子； 透射电子显微镜检查； 载体

纳米技术是当前发达国家投入最多、发展最快的科学研究和技术开发领域[1]，有关纳米颗粒与细胞之间相互作用的研究也才刚刚开始。碳纳米管(carbon nanotube, CNT)[2]和树形分子(dendrimer)[3-5]是近年来发展起来的新型多功能纳米材料。本研究观察碳纳米管-树形分子复合物转染人胰腺癌细胞的过程及其对癌细胞的影响，探讨树形分子修饰的碳纳米管作为载体的安全性。

材料与方法

一、碳纳米管-树形分子复合物的制备及表征

将0.1 mg单壁CNT(深圳市纳米港有限公司)分散于5 ml H2SO4/HNO3(3∶1)混合酸中，室温下超声处理5 h，然后搅拌24 h，过滤除去混合酸，用蒸馏水洗涤3次后，分散于2.0 ml蒸馏水中，置120℃高压灭菌25 min，加入1.0 ml 1 mmol/L的4.0代聚酰胺-树形分子(polyamidoamine dendrimer， PAMAM-D)水溶液(上海交通大学微纳米科学技术研究院生物纳米工程研究室提供)，室温下超声2 h，搅拌24 h，用0.22 μm碳酸酯膜过滤并洗涤3次，除去过量的PAMAM-D，获得CNT-PAMAM-D，调整浓度为10 g/ml。

取适量CNT-PAMAM-D滴加到云母片表面，干燥后，用原子力显微镜(atom force microscopy,AFM)直接观察；同样，适量的样品滴加到铜网表面，自然干燥后，用透射电镜(TEM，JEM-100CXII，JEOL)直接观察。

二、CNT-PAMAM-D转染人胰腺癌细胞

人胰腺癌细胞株BxPC3购于中科院上海细胞所。 常规培养后，取对数生长期的BxPC3细胞接种于10个直径10 cm的培养皿，每个皿2×105个细胞。常规培养过夜。次日弃上清，加入新鲜培养液10 ml。分成CNT-PAMAM-D组和对照组，分别加入CNT-PAMAM-D水溶液或生理盐水300 μl，继续培养12、24、36、48、72 h。倒置相差显微镜观察细胞的生长。然后弃培养液，PBS液清洗后以1%锇酸固定，Spurr包埋剂包埋，LKB超薄切片机切片，透射电镜下观察细胞超微结构。

结 果

一、CNT-PAMAM-D的结构特征

PAMAM-D与CNT结合之后，树形分子包裹在CNT的表面，形成了20 nm左右大小的复合物颗粒(图1)。

图1单壁碳纳米管(a)、PAMAM树形分子(b)及CNT-PAMAM树形分子复合物(c)形态 (原子力显微镜)

二、CNT-PAMAM-D进入人胰腺癌细胞的过程

首先，CNT-PAMAM-D黏附在细胞表面(图2a)，然后胰腺癌细胞通过细胞吞饮方式将CNT-PAMAM-D吞入(图2b)。12 h后CNT-PAMAM-D分布在粗面内质网周围(图2c)，部分被溶酶体吞噬。36 h后，CNT-PAMAM-D不仅位于胞质，还定位于胞核中(图2d)。72 h后，细胞形态仍完好，细胞器、胞核的核膜及线粒体结构均完整，但有溶酶体吞噬残体，部分细胞的胞质内出现散在的空泡囊，泡内含有颜色较深的小颗粒(图2e)。

图2CNT-PAMAM-D复合物先黏附细胞膜(a ×17000)，然后被细胞吞饮(b ×33000)；12 h后位于细胞质中，部分被溶酶体吞噬(c ×9700)；36 h后出现在胞核中(d ×5800)；72 h后胞质内出现散在空泡囊，内含深色颗粒，可见溶酶体吞噬残体(e ×17500)

讨 论

传统采用的病毒载体基因治疗技术存在转染效

率低、有免疫原性和潜在的致瘤性，出于安全性等考虑，已经在临床上被禁止使用[6-7]。开发无毒而高效的基因载体越来越受到重视。近年来纳米载体己被视为突破基因转移瓶颈最有前途的技术之一[8]。纳米载体无免疫原性和细胞毒性，具有很高的基因转移效率，可浓缩、保护和缓释所载基因，在体内可生物降解[9-10]。

CNT是一类高硬度、稳定、中空的一维大分子纳米材料，分子动力学模拟与实验都已证实CNT能够携带核酸或蛋白质等分子快速自由进入细胞质与细胞核。但CNT含有一些金属催化剂，如铁、镍等，当这些物质进入细胞之后可能会引发氧化还原反应，产生过氧化氢及自由基，损伤DNA，进而损伤细胞。Cui等[11]实验表明，经过CNT处理的细胞，其黏附性能会受到严重影响，进而引起细胞脱壁、悬浮和皱缩，同时CNT会引起凋亡相关基因上调，使细胞阻滞在G1期，最终导致细胞凋亡。

PAMAM-D是合成的、 高分枝的、 球形的、 单粒分散的纳米大分子，是一类新型阳离子多聚物高分子聚合物，其结构参数如尺寸、外形、表面化学都可以在合成的过程中获得完全控制[12]。在生理条件下，通过其表面所携带的胺基正电荷阳离子与细胞膜表面带有负电荷的糖蛋白及磷脂相互作用，以胞饮方式进入胞质。树形分子还可诱发脂质双层出现纳米孔，提高其转染效率。PAMAM- DNA复合物可以穿越包括网状内皮系统和血-脑屏障等多种生物屏障，到达各特殊部位，因此是一种高效的基因递送载体。体内外实验表明， PAMAM比其他阳离子载体粒径小、Zeta电位高，更有利于通过细胞吞饮方式进入细胞，基因转染效率高于其他阳离子载体[13-14]，并具有良好的生物相容性、无免疫性。树形分子修饰CNT后，通过静电作用能有效保护DNA免遭核酸酶的降解，降低CNT对细胞的毒性作用，因此，CNT与树形分子组合在一起，应该是一种非常有前景的、安全高效的基因递送载体[15]。

本实验结果显示，胰腺癌细胞主要通过细胞吞饮方式将CNT-PAMAM-D吞入细胞中。随着时间的延长，CNT-PAMAM-D不仅位于胞质，还可进入胞质中的溶酶体及胞核中，而胰腺癌细胞形态始终完好，表明CNT-PAMAM-D对细胞无明显损伤，是具有良好应用前景的微载体物质。

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2010-08-26)

(本文编辑：吕芳萍)

Morphologicalchangesofpancreaticcancercellstransfectedbydendrimermodifiedcarbonnanotubes

CHENGDong-feng,WUXu-bo,WANGJia-xiang,HANBao-san,ZHANGXue-qing,YANGHao,YUANHeng-guang,ZHUPing,PENGCheng-hong.

DepartmentofGeneralSurgery,RenjingHospital,MedicalSchool,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200025,China

WUXu-bo,Email:xubowu@yahoo.cn

ObjectiveTo observe the process of polyamidoamine dendrimer modified single walled carbon nanotubes complexes (CNT-PAMAM-D) entering into pancreatic cancer BxPC3 cells, and to evaluate its safety as a vector.MethodsThe CNT-PAMAM-D were prepared by ultrasound, mixing and rinsing, and the morphology was characterized by atom force microscopy and transmission electron microscope. Then the prepared CNT-PAMAM-D was incubated with human pancreatic cancer cell line BxPC3 cells for 12, 48, 72 hours, and then the cells were collected. Distribution of CNT-PAMAM-D in cells and cell ultrastructure was observed by transmission electron microscopy.ResultsAfter the combination of PAMAM-D and CNT, the surface of CNT was surrounded by dendrimer and nanocomposite particles with a size of 20 nm was formed. It was showed that CNT-PAMAM-D could be transfected into human pancreatic cancer cells by cell pinocytotic way, and it entered cytoplasm at 12 h. With the extension of the transfecting time, CNT-PAMAM-D could enter lysosomal and nucleus, but the morphology and ultrastructure ocf BxPC 3 cells was not significantly changed.ConclusionsThe CNT-PAMAM-D is a highly effective and safe nano vector.

Pancreatic neoplasms; Carbon nanotubes; Dendrimer; Transmission electron microscopy; Vector

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.04.012

上海市科委基金项目(09140902300，10411968500)，国家自然科学基金项目(30772105)

200025 上海，上海交通大学医学院附属瑞金医院普外科，消化外科研究所(程东峰、王加祥、韩宝三、彭承宏)；上海市闵行区中心医院(吴旭波)；上海交通大学微纳米科学技术研究院(张雪清、杨浩、袁恒光)；上海交通大学医学院电镜教研室(朱萍)

吴旭波，Email：xubowu@yahoo.cn