一种地衣芽孢杆菌表达载体的构建

欧阳文 刘 军* 李俊辉

(1、武汉工业学院 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2、华中农大浦城绿康生物工程研究所，湖北 武汉 430070)

一种地衣芽孢杆菌表达载体的构建

欧阳文1刘 军1*李俊辉2

(1、武汉工业学院 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2、华中农大浦城绿康生物工程研究所，湖北 武汉 430070)

用PCR方法从地衣芽孢杆菌WH-08基因组DNA中分别扩增α-淀粉酶基因amyL启动子PamyL和终止子TT，用重叠PCR技术将两者连接，重叠PCR产物用Hind III和EcoR I双酶切后，与经相同酶切的载体PHY300 PLK连接，构建重组质粒PHY-PamyL-TT。该重组载体的构建为外源蛋白在地衣芽孢杆菌中的高效表达奠定了基础。

地衣芽孢杆菌；重叠PCR；表达载体

芽孢杆菌具有良好的分泌特性，其发酵工艺和产物回收技术也较成熟，用作外源蛋白的分泌型宿主菌，具有很大的潜力[1]。以往主要以枯草芽孢杆菌表达外源蛋白，但研究发现，地衣芽孢杆菌作为蛋白表达宿主有较多优势。地衣芽孢 杆菌是一种革兰氏阳性的腐生性微生物，广泛分布于土壤和其它自然环境中，具有耐热，酶系丰富，产酶量高，安全等诸多优良特性，是芽孢杆菌中较具应用潜力的菌种之一。与枯草芽孢杆菌相比，地衣芽孢杆菌生长温度高，不仅能节省生产能源，而且也使某些酶对结合在胞壁上的蛋白酶敏感性降低；其次，其生长速率适中，容易使刚跨膜的未合适折叠的蛋白充分折叠[2]。作为高表达外源基因的宿主细胞，地衣芽孢杆菌提供了外源基因高效稳定的细胞微环境，表达产物较稳定，适合大规模工业化生产目的，且在酶产量方面，其比枯草芽孢杆菌更具优势，有成为生产工业用酶宿主菌的巨大潜力。

启动子是基因表达调控的重要顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件，适宜启动子的选择是重组蛋白高效表达的关键因素之一。地衣芽孢杆菌具有较强向胞外分泌α-淀粉酶的能力。一般来说，高效表达的基因往往具有较强的启动子。牛丹丹等[3]利用地衣芽孢杆菌自身启动子PamyL，构建表达载体在地衣芽孢杆菌中实现了α-淀粉酶基因的高效表达。本研究通过利用重叠PCR技术从地衣芽孢杆菌基因组中分别扩增α-淀粉酶基因amyL启动子PamyL和终止子TT，构建重组质粒PHY-PamyL-TT，为外源蛋白在地衣芽孢杆菌中的高效表达奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种和质粒 地衣芽孢杆菌WH-08，克隆载体PHY300PLK，均为本实验室保藏。

1.1.2 主要试剂 各种限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶、PyrobestTMDNA Polymerase、DNA Marker DL2000均购自TaKaRa公司；PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 启动子PamyL的扩增

根据amyL基因启动子PamyL序列设计引物：上游引物P1：5'-ATGCAAGCTTGTCGAC ATTGGTAACTGTATCTCAGC-3'(引物引入Hind III和Sal I酶切位点，用下划线标注），下游引物P2：5'-AGATCTTCTAGAGGATCCGGTACCGAGCTC AAGATTTGCCGCCGCTGC-3'(下划线标注多克隆位点MCS)，以地衣芽孢杆菌WH-08基因组DNA为模板，PCR扩增启动子PamyL。PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性1min→51℃退火1min→72℃延伸1min (30 个循环)，72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR回收试剂盒回收，作为重叠PCR的模板。

1.2.2 终止子TT的扩增

根据amyL基因终止子TT序列，设计引物：上游引物P3：5'-

GAGCTCGGTACCGGATCCTCTAGAAGATCT GATAGAAGAGCAGAGAGGA-3'(下划线标注多克隆位点MCS：

SacⅠ-KpnⅠ-BamHⅠ-XbaⅠ-BglⅡ),下游引物P4: 5'-GAATTCCCGGGACTAGTGCATGCGGCCGC GATCACCCGC

GATACCG-3'(下划线标注多克隆位点MCS：EcoRⅠ-SmaⅠ- SpeⅠ- SphⅠ - NotⅠ)，以地衣芽孢杆菌WH-08基因组为模板，

PCR扩增amyL基因终止子TT。PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性1min→51℃退火 1min→72℃延伸1min(30 个循环)，

72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR回收试剂盒回收，作为重叠PCR的模板。

1.2.3 启动子PamyL和终止子TT的连接

采用重叠PCR的方法，将回收的启动子PamyL和终止子TT混合，做为扩增的模板，加入P1和P4作为PCR扩增引物。PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性1min→51℃退火 1min→72℃延伸1min (30个循环)，72℃延伸10 min。扩增产物用PCR回收试剂盒回收。

1.2.4 重组质粒PHY-PamyL-TT的构建

回收重叠PCR产物，用Hind III和EcoR I双酶切后，与经相同酶切的载体PHY300 PLK连接，构建重组质粒PHY-PamyL-TT，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆。提取阳性克隆质粒，经Hind III和EcoR I双酶切鉴定后，测序分析。

2 结果与讨论

2.1 启动子PamyL的扩增

提取地衣芽孢杆菌WH-08基因组，PCR扩增amyL基因启动子PamyL，结果见图1，扩增产物与启动子PamyL大小相符（约280bp）。

图1 PCR扩增启动子PamyLM：DL2000核酸标准分子量；1~3：PCR扩增产物

2.2 终止子TT的扩增

提取地衣芽孢杆菌WH-08基因组，PCR扩增amyL基因终止子TT，结果见图2，扩增产物与终止子TT大小相符（约280bp）。

图2 PCR扩增终止子TTM：DL2000核酸标准分子量；1~3：PCR扩增产物

2.3 重叠PCR连接启动子PamyL和终止子TT

以回收的启动子PamyL和终止子TT混合物做为扩增的模板，通过重叠PCR方法，将PamyL和终止子TT连接起来。结果见图3。扩增产物大小与预计相符，在550bp处可见扩增条带。

图3 重叠PCR扩增M：DL2000核酸标准分子量：1~3：重叠PCR扩增产物

2.4 重组质粒PHY-PamyL-TT的构建与鉴定

重组质粒构建过程见图4。用Hind III和EcoR I酶切重叠PCR产物，连接到经同样双酶切的PHY300PLK上，构建重组质粒PHY-PamyL-TT。重组质粒经Hind III和EcoR I双酶切，琼脂糖凝胶电泳可见在4800bp和550bp处两条带，分别与质粒PHY300PLK以及重叠片段大小相符，见图5。测序结果表明，重组表达载体PHY-PamyL-TT构建成功。

图4 重组质粒PHY-PamyL-TT的构建

图5 重组质粒酶切鉴定M： DL2000核酸标准分子量；1：经Hind III和EcoR I双酶切的重组质粒PHY-PamyL-TT；2： 质粒PHY300PLK； 3: 重叠PCR扩增产物

本研究通过利用重叠PCR技术从地衣芽孢杆菌WH-08基因组中分别扩增启动子PamyL和终止子TT，构建重组质粒PHY-PamyL-TT，内含两个多克隆位点，方便基因的插入，为外源蛋白在地衣芽孢杆菌中的高效表达奠定了基础。

[1]Simonen M, Palva I.Protein secretion in Bacillus species [J].Microbiol Mol Biol Rev. 1993 , 57(1): 109-137.

[2]牛丹丹,石贵阳,王正祥.分泌高效蛋白的地衣芽孢杆菌及其工业应用[J].生物技术通报,2009,(6): 45-50.

[3]牛丹丹,徐敏,王正祥,等.地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆及其启动子功能鉴定[J].微生物学报,2006, 46(4): 576-580.

Q2-3

A

1673-2219（2011）12-0024-03

2011－09－25

欧阳文（1985－），湖北仙桃人，硕士研究生，主要从事应用微生物与生物技术研究。

通迅作者：刘军(1966－)，副教授，湖北南漳人，主要从事应用微生物与生物技术研究。

(责任编校：何俊华)