降解天然树脂的微生物分离与筛选

2011-11-21叶聿程徐松清李祖巍张向明谢必峰

中国造纸 2011年10期

关键词：氮源发酵液碳源

叶聿程詹伟徐松清李祖巍张向明谢必峰

(1.福建师范大学生命科学学院，福建福州，350018;2.福建嘉丰生物化工有限公司，福建永安，366000)

降解天然树脂的微生物分离与筛选

叶聿程1詹伟1徐松清1李祖巍2张向明2谢必峰1

(1.福建师范大学生命科学学院，福建福州，350018;2.福建嘉丰生物化工有限公司，福建永安，366000)

从造纸厂采集的土样中，经过富集、初筛和多轮复筛实验，分离得到了5株降解天然树脂能力较强的微生物。采用液体发酵以及稳定性复筛的方法，从这5株微生物中筛选得到了降解天然树脂能力稳定并且降解率较高的菌株Z75、Z37。分别对这2株菌株进行形态学观察，培养24 h后的菌落直径均大于1 mm，菌株Z75菌体长度小于5 μm，初步判断Z75菌株为短杆菌;菌株Z37菌体长度小于0.1 μm，初步判断Z37为细球菌。对Z75菌株的降解条件进行研究，结果显示，在35 mL的Z75菌株发酵液中，最适降解反应的树脂底物颗粒 (球形)质量为0.2 g，最适降解反应时间≥20 h;发酵条件和培养基初步优化的结果显示，Z75菌株发酵液降解天然树脂的降解率由优化前的6.5%左右提高到43.3%。

树脂障碍;天然树脂降解;微生物;分离与筛选

马尾松是制浆造纸生产的木材原料之一，其树脂含量高达3.51%，容易在制浆过程中产生树脂障碍问题［1-2］;脱墨浆和机械浆的大量使用以及纸机白水封闭循环次数的增加，使树脂障碍成为制约造纸生产效率提高的难题之一［3-5］。随着科学技术的发展，利用生物技术解决树脂障碍问题已成为近年来国内的主要研究课题［6-8］。其中，以脂肪酶为主的生物酶树脂障碍控制剂 (由不同菌株发酵产生的多种酶，按一定比例配制而成)显示出较好的效果。但是，酶制剂生产成本较高，而且使用过程中酶易失活而降低使用效果［9-11］。为了解决上述难题，本研究采用直接分离具有降解天然树脂能力的单一菌株，并通过对该微生物的发酵过程的探讨，以期实现直接利用发酵浓缩液 (单一菌株发酵产生多种酶)处理树脂。为真正实现生物法处理造纸树脂障碍的产业化应用打下基础。

1 实验

1.1 实验材料

1.1.1 土样

土样采集于福建南纸股份有限公司制浆生产线的浆渣和木片原料堆放处的土壤。

1.1.2 培养基［12］

①富集培养基

(NH4)2SO42 g，K2HPO43 g，MgSO41 g，天然树脂液10 mL，NaCl 2 g，pH值7.0，H2O 1 L。

②选择培养基

(NH4)2SO42 g，K2HPO43 g，MgSO41 g，天然树脂液10 mL，NaCl 2 g，琼脂20 g，pH值 7.0，H2O 1 L。

③液体培养基

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，天然树脂液10 mL，H2O 1 L，pH值7.0。

④斜面培养基 (LB培养基)

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～20 g，H2O 1 L，pH值7.0。

⑤发酵基础培养基

Na2HPO4·7H2O 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖 5 g， (NH4)2SO41 g，NaCl 5 g，K2HPO41 g，H2O 1 L，pH值7.5～8.0。

1.1.3 树脂底物

固体树脂取自福建沙县高桥林场。天然树脂液配制:0.5 mol/L NaOH 10 mL+天然树脂颗粒1 g。

1.2 实验仪器

pH计、移液枪、恒温摇床 (智城ZHWY-2112B)、电热恒温培养箱 (新苗DNP-9002BS-Ⅲ)、高速台式冷冻离心机 (湘仪TGL-16M)。

1.3 实验方法

1.3.1 微生物菌种的分离与筛选方法

利用天然树脂作为培养基的唯一碳源，筛选能够降解天然树脂的微生物，主要方法见文献［13］。

1.3.2 降解树脂效价的测定方法

将发酵液在6000 r/min条件下，离心分离6 min，取上清液倾入已灭菌的150 mL三角瓶中。称取均一质量的天然树脂颗粒，质量为M1，将其放入上清液中，然后在45℃，150 r/min摇床中反应24 h，然后取出天然树脂颗粒晾干称量，质量为M2。由反应前后的质量差，计算降解率，即:降解率 =(M1－M2)/M1×100%。

1.3.3 菌株形态学鉴定［14］

①菌落形态观察:将筛选到的菌株在LB培养基上划线接种，在37℃培养24 h，连续观察菌株的菌落形态变化。

②显微镜形态观察:用细菌简单染色法对培养后的菌株进行结晶紫染色，然后将染色后的玻片用油镜观察其形态。

2 结果与讨论

2.1 微生物的筛选

2.1.1 降脂微生物的分离及建立资源库

土壤是自然界中最大的菌库，因此实验采用从造纸厂环境中采集土样，并进行微生物菌种的分离。主要步骤如下:

(1)富集培养称取5 g土样置入装有50 mL无菌水的三角瓶中，振荡打散均匀后，取4 mL悬浮液加入装有40 mL富集培养基的三角瓶中，37℃，200 r/min振荡培养48 h。

(2)平板初筛将经过富集培养后的培养液进行梯度稀释，然后从稀释液中吸取0.1 mL加到装有筛选培养基的培养皿中，用无菌玻璃涂布棒在培养基的表面轻轻地涂布均匀，并在各个培养皿的对应位置中作好标记，放在37℃恒温培养箱中培养24 h。培养结果如图1所示。图1显示，以天然树脂为唯一碳源，选择平板培养基上生长的大小不同的菌落，选择生长旺盛、菌落形态较大的菌株进行划线分离，即图1中标记的菌落，挑菌培养于试管斜面。实验中共分离到99株菌株，以此建立了复筛菌资源库。

2.1.2 摇瓶筛选

依次将菌库中的菌株分批进行摇瓶复筛，将斜面的菌株接种到装有40 mL液体培养基的三角瓶中，在37℃，200 r/min振荡培养48 h，制备成种子液。然后取2 mL种子液于装有40 mL摇瓶复筛培养基的三角瓶中，在37℃，200 r/min振荡发酵培养48 h，制备成发酵液。将发酵液在6000 r/min下离心6 min，取上清液至已灭菌的150 mL三角瓶中，加入已称取的均一质量的天然树脂颗粒，在45℃、150 r/min摇床中反应24 h。通过反应前后的质量差，计算出降解率，从而选取降解率高的对应菌株。结果经过几轮的摇瓶复筛，获得降解率较高的Z75、Z37、Z53、Z77、Z70菌株，作为稳定性考察的出发菌株。最后一轮复筛的结果如表1所示。

表1 摇瓶复筛后菌株的降解率

2.1.3 稳定性考察

取初筛和复筛得到的5株菌株，做5个平行实验，进行降脂稳定性考察。结果如图2所示。由图2可以看出，Z75、Z37在5组平行实验中降解率相对较高且稳定。所以，选择这2株菌株作为复筛菌株。

图25 株菌株稳定性筛选

2.1.4 发酵液的颜色与降解率的关系

由于在发酵过程中，发酵液的颜色是发酵特性的最直观指标，研究其与天然树脂的降解率的关系，有利于今后发酵工艺的控制。由表2可以得出，降解率高的发酵液，其颜色比较深呈暗黄色，降解率低的发酵液，其颜色比较浅呈浅黄色。这提供了一个发酵过程中的参考指标。

表2 发酵液颜色与降解率的关系

2.2 菌株形态特征

2.2.1 LB平板菌落的观察

平板菌落的观察结果见表3和图3、图4。

表3 Z37和Z75菌落形态

2.2.2 显微镜观察微生物［14］

将Z75与Z37菌株通过涂片染色，在油镜下观察，结果如图5和图6所示。由图5、图6可以看出，Z37菌体长度小于0.1 μm，初步判断属于细球菌;Z75的菌体长度小于5 μm，初步判断属于短杆菌［14］。

2.2.3 降脂效价方法的研究

2.2.3.1 不同质量大小的树脂底物对降解率的影响

剪取形状近似球形的、均一的树脂颗粒，其质量分别为0.100、0.150、0.200、0.250、0.300、0.350 g，分别进行5个实验组和1个对照组的实验，研究不同质量的树脂颗粒对降解率的影响。取实验结果中平行性好的3个数据的平均值作图 (见图7)。由图7可以看出，菌株Z75在降解过程中的颗粒质量选择0.200 g最好。

2.2.3.2 反应时间的影响

在同一批菌株Z75的发酵离心液中，分别设置12、14、16、18、20、22、24 h共7个时间点，分别对7个时间点进行5个实验组和1个对照组的实验，研究降解天然树脂颗粒与反应时间的关系，取实验平行性好的3个数据的平均值作图 (见图8)。由图8可以看出，菌株Z75在降解反应过程中选择20 h及以上的降解率最好，降解率最高且稳定。

表4 发酵培养基碳源的影响

表5 培养基氮源的影响

2.2.4 菌株Z75发酵培养基的研究

2.2.4.1 碳源

用初始摇瓶筛选的LB培养基作为对照组，进行碳源对降解率的影响研究。改变基础发酵培养基的碳源种类来研究碳源对降解率的影响 (见表4)。由表4可以看出，用葡萄糖作为碳源比用多糖作为碳源时的降解率和生物量 (OD600)均高很多。并且1.0%和1.5%的葡萄糖所产生的降解率和生物量差别不大。

2.2.4.2 氮源

用初始摇瓶筛选的LB培养基作为对照组，研究氮源对降解率的影响。改变基础发酵培养基氮源的种类来研究氮源对降解率的影响，结果见表5。表5表明，用酵母粉作为氮源的降解率明显高于用牛肉膏以及无机氮源的降解率。

2.2.4.3 基础培养基初步调整结果

根据前面的碳源和氮源研究结果，对基础发酵培养基的碳源和氮源进行调整，取碳源为1.0%葡萄糖，氮源为2.0%酵母粉，其他组分及条件不变(即:Na2HPO4·7H2O 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖10 g，酵母粉20 g，NaCl 5 g，K2HPO41 g，H2O 1 L，pH值7.5～8.0)，进行实验，结果见图9。由图9可以看出，新培养基发酵液的降解率明显高于LB培养基的降解率，并且高达43.3%。

2.2.4.4 基础培养基初步调整后树脂颗粒被降解情况对比

图10为用对照组LB培养基发酵液反应后的颗粒和新培养基发酵液反应后的颗粒的实物照片。由图10可以看出，用新培养基的发酵液反应后的树脂颗粒，明显小于用LB培养基做对照的发酵液反应后的树脂颗粒，这表明调整后的培养基发酵液，对天然树脂颗粒的降解作用比较明显。

3 结论

本研究从自然界中分离出具有降解天然树脂能力的微生物，建立了微生物菌库，并在菌库中筛选出了对天然树脂降解能力强且稳定的菌株Z37和Z75。初步鉴定Z37为细球菌、Z75为短杆菌。通过对Z75菌株降解天然树脂过程中的数据评估、菌株发酵条件及培养基配方的初步调整，确定降解反应适宜的底物颗粒质量为0.200 g、降解时间为20 h以上;复筛菌株Z75的降解率由原来的6.5%显著提高到43.3%。

在国内外造纸生产中树脂障碍处理研究的报道中，至今未见有通过筛选微生物并直接利用微生物发酵液 (主要是复合酶)进行降解天然树脂以解决造纸生产中树脂障碍问题的研究。本研究尝试的初步结果显示出重要的应用前景。相信通过后期的发酵研究、制剂研究以及生产应用适应性研究，能够实现树脂障碍的微生物处理。

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Separating and Screening of Microorganism for Degrading Natural Resin

YE Yu-cheng1ZHAN Wei1XU Song-qing1LI Zu-wei2ZHANG Xiang-ming2XIE Bi-feng1，*
(1．Biotechnology of Fujian Normal University，Fuzhou，Fujian Province，350018;2．Fujan Jiafeng Bio-chemical Co．，Ltd．，Yongan，Fujan Province，366000)
(*E-mail:bfxie2004@163．com)

After enrichment，primary screening and stable repeat screening five strains of microorganism from the soil sample provided by Nanping Paper Co．，Ltd were separated，which can degrade natural resin．Using the method of liquid fermentation and stable repeat screening two strains with high degradation ability—Z75，Z37 were screened from the five strain microorganisms．After 24 h cultivation，the Morphology study of the two strains showed that the diameter of the bacterial agglutinin is ＞1mm，the length of the thalli is ＜5 μm．It is preliminary estimated that the Z75 is brevibacterium．sp and the Z37 is micrococcus varians．The primary study of degradation conditions for Z75 indicated that the optimum particle of natural resin is 0．2 g while the most appropriate cultivation time is 20 h or more．As a result of optimizing fermentation conditions and primary adjustment of culture medium，the degradation rate of Z75 rise from 6．55%to 43．3%，which is significant for using to degrade the natural resin．

pitch troubles;natural resin degrade;microorganism;separationg and screening