人参皂苷Rf的分离提纯
2011-11-20李鹏飞，何丹，鱼红闪，金凤燮
李 鹏 飞， 何 丹， 鱼 红 闪， 金 凤 燮
（大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034）
0 引 言
人参皂苷Rf具有抗肿瘤，抗疲劳的功效，能够减少子宫收缩，且起到与脑神经细胞有关联的镇痛作用［1］。人参皂苷Rf是人参中的特有皂苷［2］，常用来作为区分人参与西洋参、三七参等其他类别人参的重要指标［3-4］。因此，制备可作为对照品的人参皂苷Rf单体对鉴别人参药材具有重要意义。由于Rf这些特殊的性质，将其从人参总皂苷中分离提纯进行单独研究是非常必要的。本实验室先后对人参皂苷单体Re、Rg1进行了分离，但从未对人参皂苷单体Rf进行过研究。本论文采用甲醇浸提法提取人参根须中总皂苷，然后用硅胶柱层析法分离出人参皂苷Rf单体，为工业上大规模提取人参皂苷Rf提供了实验依据。
1 材料与方法
1.1 材 料
人参，人参皂苷标准品，薄层层析板Silica Gel-60-F254，层析用硅胶，高效液相色谱仪；色谱所用试剂为色谱醇，其他实验试剂均分析醇。
1.2 方 法
1.2.1 人参总皂苷的提取
将1 000g人参根须粉碎后用甲醇反复浸泡3次，过夜，每次甲醇用量为6L。合并浸提液浓缩干燥后用200 mL 石油醚反复脱脂3 次，脱脂后粉末溶解于适量去离子水中，然后用200mL水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇层。水洗正丁醇层脱糖，最后将正丁醇层浓缩、干燥、收集、称重，得人参总皂苷。取少量干燥样品进行HPLC检测。
1.2.2 硅胶柱层析法
制备样品胶：将分离所得人参总皂苷用甲醇和少量氯仿溶解，加入2.5 倍样品质量的80～100目硅胶，水浴蒸干，将样品胶放入干燥皿中。
装柱：取20倍人参总皂苷样品质量的300～400目硅胶作为分离胶，用漏斗慢慢装入玻璃柱内，使其铺放均匀（其间抽实硅胶），再装入样品胶，最后在最上层放置脱脂棉，装柱完成。
洗脱：用纯氯仿通柱，再用V （氯仿）∶V（甲醇）=8.5∶1.5的氯仿-甲醇洗脱液进行洗脱，待检测出Rf完全分离后将洗脱液配比换为V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶3∶0.5继续洗脱。最后收集洗脱液，浓缩，蒸干得固体粉末。
1.2.3 薄层层析法（TLC）
分别取1mg人参皂苷标准品及人参皂苷样品溶于1mL 甲醇中，制成人参皂苷溶液。将点好样品的薄层板放入层析缸中展开，展开剂配比为V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶2.5∶0.5，显色剂为10%硫酸。根据标准品对照即可确定样品中的皂苷成分。
1.2.4 高效液相色谱法检测分离产品纯度
高效液相色谱，Waters 2695；色谱柱，Knauer（5μm，250mm×3mm）；流动相A，乙腈；流动相B，水。流动相配比如表1 所示。配置样品质量分数为2%，用0.45μm 滤膜过滤后即得检测样品。柱温，35 ℃；进样量，10μL；检测波长，203nm；体积流量，0.6mL／min。
表1 HPLC检测的流动相条件Tab.1 Condition of mobile phase of HPLC
2 结果与讨论
2.1 提取人参根须总皂苷及其成分分析
按“1.2.1”提取人参总皂苷。将500g人参根须经甲醇浸泡提取，石油醚脱脂，正丁醇萃取，水洗脱糖后干燥称重，得人参总皂苷干燥粉末20.5g，提取率为4.10%。取干燥样品2mg，溶于1mL甲醇中进行HPLC检测，检测结果如图1所示。由图1可知人参根须总皂苷中含有人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd，质 量 分 数 分 别 为43.7%、2.68%、9.02%、14.0%、13.1%、10.4%、7.11%。总皂苷中Rf质量分数较高，可进行分离提纯。
图1 人参总皂苷HPLC检测图谱Fig.1 Ingredients of total ginsenoside on HPLC
2.2 硅胶柱分离人参总皂苷中的Rf
采用硅胶柱层析法分离上述人参总皂苷中Rf单体。称取20.5g人参总皂苷样品，按方法“1.2.2”分离，洗脱液开始配比为V（氯仿）∶V（甲醇）=8.5∶1.5。洗脱液分瓶收集，每瓶体积为200mL，分瓶取样进行TLC 检测。待洗脱至55瓶时，Rf洗脱完全。洗脱液配比改为V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶3∶0.5。进行TLC检测，前64瓶TLC检测结果如图2所示。
图2 人参总皂苷硅胶柱分离成分TLC检测结果Fig.2 The total gingenoside separated by silica gel column on TLC
根据TLC检测结果，对含有相同组分的收集液进行合并处理，分别用旋转蒸发仪浓缩，水浴蒸干，称重，放入干燥的容器中保存。取少量蒸干后的样品，加入少量的甲醇溶解，再次进行TLC 检测，结果如图3所示。在硅胶柱层析分离中，1～17瓶中，除7、8瓶其他均无皂苷洗脱出来，所以TLC检测无皂苷条纹显示。人参总皂苷各洗脱组分收集情况见表2。由表2可知，20.5g人参根须总皂苷经硅胶柱分离后，得到较纯人参皂苷单体Rf 0.410g，在总皂苷中的得率为2.05%，在人参根须中总得率为0.082%。同时得到副产物人参皂苷单体Rg11.64g，得率为8.20%；皂苷Ra组0.350g，得率为1.75%。
图3 合并样品的TLC图谱Fig.3 The collected total ginsenoside on TLC
表2 人参总皂苷洗脱收集表Tab.2 Prepare for separation by silica gel column
2.3 HPLC检测分离人参皂苷单体的纯度
采用HPLC 方法检测分离后的人参皂苷Rf纯度。精密称取前上述分离获得的人参皂苷单体Rf、Rg1及皂苷Ra组各2mg，分别溶于1mL 色谱甲醇，过滤得2mg／mL的供试品。人参皂苷单体Rf的HPLC检测图谱如图4所示。
图4 人参皂苷Rf的HPLC图谱Fig.4 Ginsenoside Rf on HPLC
由图4可以看出，人参根须总皂苷经硅胶柱层析分离得到的人参皂苷Rf单体纯度较高，可达到93.0%。同时检测副产物Rg1纯度为81.0%，Ra组纯度为61.0%。
3 结 论
从500g人参根须分离提取得到20.5g人参总皂苷，提取率为4.10%，其中人参皂苷Rf的质量分数为9.02%。硅胶柱分离得到人参皂苷单体Rf 0.410g，在总皂苷和人参根须中的得率分别为2.00%和0.082%。同时得到人参皂苷Rg11.64g（8.20%）；皂苷Ra组0.350g（1.75%）。经检测人参皂苷单体Rf的纯度为93.0%，副产物Rg1纯度为81.0%，Ra组纯度为61.0%。经分离后得到的Rf纯度较高，可为以后对Rf这种人参特有皂苷进行单独研究打下基础，并为工业上大规模提取人参皂苷Rf提供理论依据。
［1］金凤燮.天然产物生物转化［M］.北京：化学工业出版社，2009，84：90-91.
［2］窦德强，靳玲，陈杰英.人参的化学成分及药理活性的研究进展与展望［J］.沈阳药科大学学报，1999，16（2）：15.
［3］何耀慧，林荣锋，陈剑平，等.人参、三七在复方芪术调经散中的高效液相色谱法鉴别［J］.广州中医药大学学报：自然科学版，2009，26（5）：468-470.
［4］李丽，刘春明，吴巍，等.高效液相色谱-电喷雾质谱联用法测定人参和西洋参的皂苷类成分［J］.分析化学研究报告，2005，33（8）：1087-1090.
