不同改性方法对蛋白质溶解性的影响研究进展

任为聪 程建军 张智宇 赵伟华 朱秀清

(东北农业大学食品学院1，哈尔滨 150030)

(国家大豆工程技术研究中心2，哈尔滨 150030)

不同改性方法对蛋白质溶解性的影响研究进展

任为聪1程建军1张智宇1赵伟华1朱秀清2

(东北农业大学食品学院1，哈尔滨 150030)

(国家大豆工程技术研究中心2，哈尔滨 150030)

溶解性是蛋白质主要的功能特性之一，更重要的是，溶解性是蛋白质生理功能特性及其他加工功能特性的前提和基础。通过对蛋白质溶解性的物理、生物酶及化学改性3大类改性方法进行了分类论述，分析了不同改性方法对蛋白质溶解性的影响。其中，物理方法介绍了微波、超声波及热处理等方法;生物酶方法介绍了木瓜、碱性及胰蛋白酶等处理方法;化学方法介绍了不同活性基团的改性方法。分别对各种改性过程中蛋白质的结构变化和蛋白质溶解性提高的机理进行了初步探讨。通过物理、生物酶和化学等方法等来引起分子结构的微变化，可使人们获得各种符合预期的性能优良的蛋白产品。

改性 蛋白质 溶解性

蛋白质产品由于良好的功能特性和较高的营养特性已经被广泛的应用于食品行业，用来改善食品的质地和营养等。依据来源，蛋白质产品可分为植物性蛋白质产品和动物性蛋白质产品。由于不同来源蛋白质的氨基酸组成的差异，造成了蛋白质功能性的差异［1］，其中溶解性是蛋白质的一个重要的功能特性。蛋白质的自身结构和溶液中的pH值、离子强度以及温度等都是蛋白质溶解性重要的影响因素［2］。蛋白质的溶解性可表达为氮溶解指数(NSI)和蛋白质分散指数(PDI)2种。

大量的研究发现蛋白质的功能性与溶解性有着密切的联系，通过蛋白质的溶解性来体现其他的功能性［1，3］。随着蛋白质溶解性的提高，蛋白质的凝胶性、乳化性和发泡性都得到了相应的提高［4－8］，因此提高蛋白质的溶解性具有重要的意义。随着蛋白质改性技术的不断发展和研究手段的不断更新，蛋白质改性的机理的研究不断深入，研究表明蛋白质结构的变化直接影响蛋白质的溶解性。现在，通常采用物理方法、生物酶方法和化学方法改变蛋白质高级结构、肽链长度和侧链基团，从而提高蛋白质溶解性。本文将对这3大类蛋白质溶解性的改性方法进行比较和总结。

1 物理改性蛋白质溶解性

物理改性就是利用机械剪切力、热(辐射)、声、电场、高压和超声等物理方式对蛋白质的空间结构进行修饰，促使蛋白质空间结构发生改变，造成蛋白质中亲水性氨基酸残基向蛋白质外部迁移，从而使蛋白质水和能力加强，溶解度提高。

1.1 超声波改性

超声波的瞬态空化作用使能量密度高度聚集，故能在崩溃瞬间作用产生高压、高温等一系列极端物理效应［9］，从而使蛋白质分子发生了结构的变化，溶解性提高。利用超声波处理可较好的提高蛋白质的溶解性。

研究证实，超声处理有效地提高了蛋白质的溶解度，Wanlop Chanasattru等［10］认为经超声波处理过的球状蛋白质，蛋白质分子性质和在溶剂化能力发生了改变，使得蛋白质体积缩小，在溶剂中的可压缩性增强，从而使蛋白质更易分散在溶剂中。同样Jambrak等［4－5］利用20 kHz的超声波探头处理乳清蛋白和大豆蛋白后，认为蛋白质溶解性明显提高的原因是由于超声波的空化作用使得蛋白质结构展开，肽健断裂，蛋白质分子质量减小，更多的亲水性氨基酸处在外层;但Chuan－He Tang等［11］持相反的意见，其研究表明经超声波处理过的大豆分离蛋白，在溶解中形成了可溶性聚合物，这个聚合物主要依靠分子间疏水作用，氢键和二硫键来维持其稳定的。

超声处理从根本上改变了蛋白质原有的结构特性，因此提高了蛋白质溶解性。研究学者对超声处理过程中蛋白质的结构变化存在不同的观点，一种认为是蛋白质分子质量的减小，蛋白质亲水性氨基酸残基增多，溶剂化能力提高造成的;另一种认为是蛋白质聚合，将疏水性氨基酸残基掩蔽在聚合物中心，使外层亲水性氨基酸残基数量相对增高，溶解性提高。造成这两种截然相反的结果可能和处理样品的浓度、温度、pH值及超声波设备频率的不同所造成的。

1.2 热改性

正常情况下，绝大多数的人考虑到，高温会使蛋白变性，也就是说蛋白质经热处理后，肽链舒展结构发生变化，大量疏水性基团暴露在蛋白质表面，蛋白质发生热变性，蛋白质溶解性急剧下降［1］。但是，很多研究却得到了不同的结果:Estela L Arrese、S Petruccelli和 Jorge R Wagner等［12－14］研究者对高温处理后的大豆分离蛋白溶解性进行了研究，发现100℃处理后的大豆分离蛋白仍然具有较高的溶解性。

我们通过热处理高温变性豆粕，蛋白质的溶解度也得到显著的提高。通过研究发现高温条件下大豆分离蛋白的高溶解性是由于7S和11S之间的亚基通过二硫键重新结合，疏水作用力使得疏水性基团向新聚合物中间聚集，形成可溶性聚合物，因此加热在一定条件下可以提高蛋白质的溶解性。

1.3 微波改性

Choi等［15］利用微波技术对大豆进行处理，结果发现大豆细胞微结构明显被破坏，能明显的提高可溶性大豆蛋白的含量。经过微波处理过的鳕鱼可溶性蛋白质，经SDS－PAGE分析发现分子质量明显降低，较大分子质量的亚基消失，出现两条20 ku的新条带，证明鳕鱼蛋白质通过微波处理后发生了降解作用［16］，使得鳕鱼可溶性蛋白质含量提高。微波造成水分子激烈的原地震动，使得水分子与蛋白质分子相互碰撞次数增加，这种震动和撞击造成了大量的能量聚集，当达到一定程度后便会向外释放大量热［17］。由于微波的辐照和产生的大量热从而导致蛋白质空间结构发生变化，蛋白质分子质量减小，亲水性氨基酸残基大量暴露，溶剂化能力增强，蛋白质溶解性提高。

1.4 静态超高压改性

食品的高压处理技术，一般是指将密封于柔性容器内的食品置于以水或其他液体作为传压介质的压力系统中，采用高静水压处理食品，以达到杀菌、抑酶和改善食品的功能特性等作用。静态超高压能使蛋白质分子相互聚合成为聚合物，分子质量增大，有利于与水相互作用，在水中形成100～200 nm的微粒。试验证明，压力从0～600 MPa，蛋白质溶解性先下降后上升［18］。Wang XianSheng 等［6］发现经过静态超高压处理过的不同品种大豆分离蛋白，随着压力的增大，溶解性呈现非线性的变化，并且达到最大溶解度时所需的压力不同。通过对表面疏水性和表面巯基的测定发现，蛋白质高级结构在处理过程中不断变化，蛋白质疏水作用力和共价键(二硫键)共同决定着可溶性蛋白质的高级结构。

伴随着压力的变化，蛋白质发生聚合，形成分子质量更大的聚合物，这些聚合物将阻碍蛋白质溶解的疏水性氨基酸残基掩蔽在聚合物中心，这些疏水性氨基酸残基相互作用形成了蛋白质非共价键维持聚合物的稳定性。由于非共价键的键能较低较不稳定，因此，当聚合物初步形成时，中心部分半胱氨酸残基相互作用形成更为稳定的共价键(二硫键)。

1.5 超高压均质改性

均质处理过程中，剧烈的处理条件，如高压、剪切力、空穴爆炸力和温度会导致蛋白质特性的变化。对经过超高压均质改性处理过的蛋白质溶解性提高的机理，学术界持两种观点，一种是Sang－Ho Lee等［19］研究发现经过超高压均质处理的乳清蛋白，蛋白质二级结构的α－螺旋和β－折叠均减少，高级结构舒展，大量疏水基团暴露并相互之间吸引，形成可溶性聚合物。而另一种是涂宗财等［20］认为经过超高压均质处理的花生蛋白质的肽链被打开，溶解度上升。这是由于凝聚的球状的大豆分离蛋白经处理后逐渐解缔和伸展，蛋白质分子解聚成一些更小颗粒亚基单位(7S的三聚体解聚变成单链，11S的亚基分离)而且亚基单位进一步有一定程度的伸展，使得球状蛋白质内部的极性基团和疏水基团暴露出来，蛋白质分子(颗粒)的表面电荷分布加强，围绕着新暴露的极性基团的结合水增多，蛋白质的水化作用增强，溶解性也得到了改善［21］。

1.6 脉冲电场改性

Li Yingqiu等［22］利用脉冲电场对大豆分离蛋白处理后，发现调整适当的脉冲强度和时间，大豆分离蛋白产生极性并且亚基分解、高级结构开始伸展，分子构象变化，导致表面巯基和表面疏水基团被埋藏于分子内部，增强了蛋白质与水的相互作用，使得蛋白质溶解性提高。

不同的物理改性方法都不同程度的提高了蛋白质的溶解性，其主要通过极端的物理效应改变蛋白质二、三和四级结构，或形成以不同化学键连接的可溶性聚合物，使蛋白质亲水基团外露，蛋白质溶剂化能力提高，溶解性及其他相关功能性得以提高。但具体的反应机理尚无统一定论，有些仍存在相反的理论假设，因此需要科研人员不断的探索，去找到真正的答案。通过物理改性的蛋白质无毒副作用，可大规模生产，但耗能较多。

2 酶法改性蛋白质溶解性

蛋白的酶法改性是指通过蛋白酶部分降解蛋白质，或增加其分子内或分子间交联或连接特殊功能基团，改变蛋白质的功能性质。酶按来源可分为动物性蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶等)、植物性蛋白酶(菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶等)和微生物蛋白酶(Alcalase碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶等)。

2.1 植物性蛋白酶改性

植物蛋白酶一般为半胱氨酸蛋白酶，主要裂解化学键在Lys/Arg/Phe的羧基(木瓜蛋白酶)、Phe/Tyr的羧基(无花果蛋白酶)和Lys/Arg/Phe/Tyr的羧基(菠萝蛋白酶)［1］。Kazunobu Tsumura 等［7］利用木瓜蛋白酶控制性水解大豆分离蛋白的β－半球蛋白，结果发现β－半球蛋白水解液冻干粉在pH 7.0和pH 8.0时的溶解性和凝胶型均高于大豆分离蛋白，并且黏度较低。B P Lamsal等［8］利用菠萝蛋白酶对大豆粉、大豆分离蛋白、挤压大豆粉和大豆浓缩蛋白进行了2%和4%的限制性酶解，由于酶解使得可电离氨基酸和羧基基团的大量暴露使得限制性水解后的蛋白溶解性明显高于未水解对照样。

2.2 微生物性蛋白酶改性

微生物酶大部分为丝氨酸蛋白酶，主要裂解化学键在疏水性氨基酸的羧基;只有中性蛋白酶为金属蛋白酶，其作用在 Leu/Phe的氨基［1］。Jin－Yeol Lee等［23］利用0.05 ～0.2 mol/L 的弱酸对脱脂豆粉进行预处理，再利用Alcalase碱性蛋白酶和复合蛋白酶分别进行酶处理。结果这种复合处理使蛋白质溶解性达到95%以上，并且蛋白溶液的黏度相对较低。Stein Ivar Aspmo 等［24］利用 Alcalase1 2.4 L，Neutrase1 0.8 L，ProtamexTM，木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶，混合植物蛋白酶等6种不同来源的蛋白酶对大西洋鳕鱼蛋白进行了改性处理。经处理后的蛋白质的氮溶解指数均在80%以上，并且α－氨基酸含量上升后趋于平缓。Walsh等［25］对大豆分离蛋白先用Alcalase限制性水解，再用谷氨酞胺转移酶交联化处理，其溶解度在pH 3.0～5.0条件下明显提高;其中在水解度为2%时经交联化后，在低pH下大豆分离蛋白溶解度最大。经这种方法处理大豆蛋白在低酸性食品和饮料中有很大用途。

2.3 动物性蛋白酶改性

动物性蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶两类，主要作用化学键为Lys/Arg的羧基(胰蛋白酶)，芳香族羧基和氨基、Leu/Asp/Glu的羧基(胃蛋白酶)［1］。Sook Y Kim 等［26］利用胰蛋白酶控制性水解大豆蛋白，结果发现明显提高了大豆蛋白的乳化性和溶解性。Guan Xiao等［27］和 Yin ShouWei等［28］利用胰蛋白酶分别水解米糠蛋白和麻蛋白，分别控制水解度在4.1% ～8.3%和2.3% ～6.7%，得到与Sook Y Kim等［26］相类似的结果，麻蛋白的溶解性、乳化性、乳化稳定性、保水性和持油性均得到了不同程度的提高。Iskender Arcan等［29］利用胃蛋白酶对鹰嘴豆蛋白在37℃下水解24 h，结果发现可溶性蛋白质是原来的1.2～2倍，自由基清除能力是原来的1.9～3倍，并且在油水乳化体系中抗氧化能力和金属螯合能力均得到增强。

酶法改性是通过修饰或切断蛋白质氨基酸侧链和肽链，去除蛋白质疏水性基团，破坏蛋白质高级结构，使蛋白质的分子质量减小，更多的亲水性氨基酸残基与水接触，完成提高蛋白质溶解性的过程。不同来源的酶由于其作用位点的差异，造成了酶改性后蛋白质侧链基团和肽链长短的的不同，但对于提高蛋白质溶解性的作用机理相类似。酶法改性安全可靠，但深度水解后的蛋白质其他功能特性往往因为高级结构的破坏而下降。

3 化学改性蛋白质溶解性

利用化学方法引入化学基团，交联在蛋白质肽链上，从而改变蛋白质的功能特性。通过引入带负电荷的基团来改变蛋白的等电点，使它在中性或微酸性介质中仍具有良好溶解性。引入一些含有硫醇基、双硫基等基团，能提高植物蛋白的黏弹性、凝胶性。经亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和半胱氨酸处理后，使蛋白质分子间和分子内的二硫键断裂、亚基伸展、疏水基暴露，使大豆蛋白分散性和溶解性提高。

表1 蛋白质的一般化学改性方法［30－31］

3.1 磷酸化改性

蛋白磷酸化就是有选择地利用蛋白质侧链活性基团，分别结合一个磷酸根基团，从而大量引进磷酸根基团，通过改变蛋白质的电负性，提高了蛋白质分子之间的静电斥力，使之在食品体系中相互排斥，更易于分散，因而能够提高蛋白质的溶解性和聚结稳定性，并改变了等电点［1，30］。化学磷酸化效率高、功能特性改善明显、磷酸化试剂价格低廉、易于实现工业化等优点深受重视。S K Nayak等［31］在水牛乳蛋白中(酪蛋白、沉淀物和乳清蛋白)添加POCl3进行了磷酸化处理。结果发现乳清蛋白在水溶液，Na盐溶液和Ca盐溶液中的溶解性均明显提高。亲水性磷酸基团被交联在蛋白质侧链，使得蛋白质的亲水性增强，溶解性提高。

Ross和 Campbell等［32－33］用酶法对大豆蛋白进行了磷酸化处理并对功能特性进行了深入研究，结果表明，酶磷酸化的大豆蛋白的溶解性有明显的改善并且反应能在较温和的条件下进行。

酶法磷酸化较化学磷酸化反应条件更温和，安全性更高，但反应效率及反应速率较慢。

3.2 酰基化改性

酰基化作用就是蛋白质分子的亲核基团(如氨基或经基)与亲电基团(如拨基)相反应，从而在大豆蛋白分子结构中引入亲水基团［1］。利用琥珀酸酐和棕榈酸N－羟琥珀酰亚胺酯做为酰化剂，使琥珀酰基和棕榈酰基与大豆分离蛋白(SPI)共价结合。结果表明琥珀酰化改性大豆蛋白分子中的氨基被琥珀酰基所取代，分子的净负电荷增加，表面非极性基团减少，分子柔性增强，因而水溶性增加，表面疏水性下降。棕榈酰化改性过程中，疏水性棕榈酰基的引入增加了蛋白质的疏水性;同时高浓度的脲使大豆球蛋白分子展开，内部疏水基团暴露，疏水相互作用增强，蛋白质趋于聚合和沉淀，溶解度下降［34］。

3.3 磺酸化改性

蛋白质在高热和高剪切力条件下发生热变性，形成结构复杂并且稳定的蛋白质产物，主要由非共价键(氢键、疏水作用力和范德华力等)和共价键(二硫键)连接。对膨化后的产物进行化学处理，加入尿素破坏非共价键，加入DTT(或β－巯基乙醇)破坏共价键(—S—S—)，从而进行磺酸化，使原本呈高度疏水性的蛋白质结构变为松散的长肽链，亲水性氨基酸残基充分与水相互作用，使得蛋白质溶解性升高［35－37］。

3.4 表面活性剂改性

Anupam Malhotra等［38］将表面活性剂用来改性大豆分离蛋白质，结果发现阴离子表面活性剂SDS对溶解性影响最大，使得分离蛋白在等电点附近仍具有较高的溶解性。这是由于SDS改变蛋白质的表面性质，发生结团现象，亲水性基团外露，使得蛋白质更具亲水性。

化学改性通过引入亲水性化学基团或断裂化学键对蛋白质进行修饰，完成掩蔽和包埋蛋白质疏水性氨基酸残基的目的，或直接引入亲水性极强的基团，使蛋白质表面亲水性提高，来达到提高蛋白质溶解性的目的。化学改性方便、快捷，并且改性效果十分显著，但改性后蛋白质的安全性问题一直被人们所关注。

4 展望

蛋白质具有良好的营养价值和加工特性，尤其加工特性和功能特性依赖蛋白质良好的溶解性，因此通过改性技术提高蛋白质溶解性是成为改善蛋白质功能性的主要手段。

3类蛋白质改性技术对蛋白质溶解性的提高都有一定的作用，但是还有许多地方需要深入的研究与探讨。由于改性中反应机理的尚无统一，因此改性过程中提高蛋白质溶解性的机理研究将成为研究工作者下一步的研究热点。物理改性的能耗问题，化学改性中的毒理问题以及生物酶改性中蛋白质其他功能性下降问题，都将是急需解决的关键技术。此外，复合改性技术在提高蛋白质溶解性，改善其他功能特性的研究将是主要的目标。

总之，随着科学技术手段的不断进步，蛋白质溶解性改性的方法将也不断被更新，使得蛋白质加工技术得到良好的发展，将有更多更好的蛋白质走入人们的生活中。

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Study on Different Modification Methods on Solubility Properties of Protein

Ren Weicong1Cheng Jianjun1Zhang Zhiyu1Zhao Weihua1Zhu Xiuqing2
(College of Food Science，Northeast Agricultural University1，Harbin 150030)
(National Soybean Engineering and Technique Research Center2，Harbin 150030)

Solubility is one of major functional features of the protein.In particular，it is the precondition and basis for physiologic function and other processing functions of the protein.In this paper，three modification methods，including physical，biologic enzyme and chemical modification，on solubility properties of protein，were summarized，to analyze the effects of different modification method on protein solubility.The solubility modification of protein via physical ways including microwave irradiation，ultrasound，heat treatment and so on are reviewed;for the enzymic ways，the modification using papain，alaclase and trypsin was discussed;for the chemical ways，the different active groups were reviewed.The above modification methods might cause microvariation of protein molecular structure so that the people could obtain various high－quality protein as anticipated.

modification，protein，solubility

TS201.2

A

1003－0174(2011)08－0123－06

黑龙江省科技计划(GB08B401－02)

2010－08－15

任为聪，男，1985年出生，硕士，农产品加工与储藏

程建军，男，1969年出生，副教授，植物蛋白与多糖的综合利用