不同储存温度对王浆主蛋白及其生理活性的影响

王 婷 杨 旭 (郑州大学第二附属医院检验科,河南 郑州 45004)

王浆作为保健品,其保存条件受到关注,上世纪 90年代Chen等〔1〕检测了 -20℃、4℃和室温条件下 7个月内王浆质量的变化,发现在室温下王浆发生褐变,黏性显著增加,水溶性蛋白发生降解,而在 -20℃下变化不大,并采用 SDS-PAGE技术检测出 4～5种蛋白随着温度的升高和时间的延长而逐渐降解。Kamakura等〔2〕利用色谱和 PAGE技术比较不同储存条件下王浆蛋白成分,发现一种 57 kD糖蛋白可作为王浆新鲜度的指标。此糖蛋白的降解速度与储存温度和储存时间成正比。本研究利用双向电泳技术分析在室温下储存 30 d以及室温、4℃、-20℃各储存 80 d的王浆蛋白质组分之变化,以期探明不同储存温度对王浆蛋白成分的影响,这将为科学合理的储存和利用王浆奠定基础,并进一步探索王浆新鲜度评价指标。

1 材料与方法

1.1 样品 所有王浆样品均取自中国农业科学院蜜蜂研究所实验蜂场。王浆从台基中取出立即装入无菌 Ep管中,分别冷冻于 -20℃、冷藏于 4℃、存放在室温下。

1.2 蛋白提取和蛋白浓度测定 室温储存 30 d以及室温、4℃和 -20℃储存 80 d的王浆提取总蛋白。蛋白提取方法根据钟伯雄等〔3〕报道的方法稍做改良,提取的蛋白样品溶液直接使用或是 -70℃冷藏备用。采用 Bradford法进行蛋白质浓度测定,595 nm波长处测定吸收值。

1.3 双向电泳 (2-DE)和图像分析 使用 17 cm IPG胶条 (pH 3～10线性),在 18℃按以下程序进行第一向等电聚焦 (PROTEAN IEF Cell,Bio-Rad Hercules,CA,USA):50V,主动水化 14 h;250 V,除盐 30 m in ×4次;1 000 V,60 m in再次除盐;9 000V,线性升压 5 h;9 000 V,聚焦 60 000 V/h。第一向聚焦结束后,将IPG胶条用平衡缓冲液平衡,然后进行第二向电泳 (PROTEANⅡ xi Cell,Bio-Rad Hercules,CA,USA):恒流 25 mA/gel。电泳结束后用 CBB G-250进行凝胶染色。每个样品重复 5次双向电泳。染色后凝胶使用透射模式进行扫描 (PDQuest V 7.3.0,Bio-Rad Hercules,CA,USA),并用总密度方法标准化处理。

用 ANOVA 6.12(SAS Institute,Cary,N.C.,USA)比较 4个样品中经标准化处理的共有蛋白点含量。

2 结 果

结果显示室温储存 30 d的王浆以及室温、4℃和 -20℃储存 80 d的王浆蛋白点总数分别为 63(图 1A)、69(图 1B)、45(图1C)和 75(图 1D)个,分子量范围为 7.64～72.33 kD,等电点在4.95～8.70范围内。

与此前发表过的王浆蛋白质 2-DE图谱进行比较定位王浆主蛋白 (Apalbum in)〔4〕,分析它们在不同储存条件下的含量变化。Apalbum in 1在各储存条件下均为过饱和点。Apalbum in 2和Apalbum in 3在各储存条件下的含量变化不规律:在 -20℃条件下含量最高或者只出现在 -20℃的蛋白点共有 18个;在4℃条件下含量最高或只出现在 4℃的蛋白点共有 13个;只出现在室温 30 d或者在室温 30 d条件下含量最高的蛋白质点有5个;只出现在室温 80 d或者在室温 80 d条件下含量最高的蛋白质点有 14个。7个 Apalbum in 4蛋白点和 3个葡萄糖氧化酶蛋白点只在 -20℃下可见。蛋白点 Apalbum in 5在 4℃条件下可见 3个;在 -20℃可见 6个;在两种室温条件下未见 Apalbum in 5蛋白点。

图 1 不同储存条件下王浆蛋白双向电泳图谱

3 讨 论

Apalbum in 1在本次实验的 4种储存条件下均为过饱和点,说明对于温度和时间这两个储存条件不敏感。4种储存条件下共有的 Apalbum in 2和 Apalbumin 3蛋白含量并未随着储存温度的升高和时间的延长而发生明显减低,有的反而在室温 80 d条件下含量最高,这可能是王浆蛋白发生聚集的缘故,也可能是 Apalbumin 2和 Apalbumin 3多态性的表现〔1〕。Apalbum in 1主要是促进肝细胞再生、保护肝细胞及营养功能;Apalbum in 2和 Apalbumin 3的功能是氮储存,同时 Apalbum in 3还具有免疫调节作用〔5,6〕,这 3种王浆主蛋白对储存温度不敏感,所以常温储存也许不会对它们的功能产生太大影响。Apalbum in 4和葡萄糖氧化酶的蛋白点只出现在 -20℃80 d条件下,其余 3种储存条件均未见,表明 Apalbum in 4和葡萄糖氧化酶对于温度非常敏感。就 Apalbumin 4的温度敏感性和本次实验所测得的分子量 54.57～59.10 kD来看,与 Kamakura等〔2〕报道的一种可作为王浆新鲜度指标的 57 kD糖蛋白基本吻合。在 Sano〔7〕之前一直未能用双向电泳的方法鉴定出 Apalbumin 4的存在,可能是因为其温度敏感性,在样品收集、运输或者制备过程中发生了降解。本实验所用王浆从台基收集后立即存放于 -20℃,4℃、室温,因此最大程度减少了中间环节,保证样品的新鲜。Apalbumin 5出现于 4℃和 -20℃ 80 d条件下,而室温 30 d和80 d未见,并且在 4℃条件下的蛋白点含量明显低于 -20℃,说明Apalbumin 5对储存温度比较敏感,但敏感性没有 Apalbumin 4和葡萄糖氧化酶高。Apalbum in 4和 Apalbum in 5的功能是以必需氨基酸形式提供营养〔3〕,但由于它们的温度敏感性,必需冷藏才有可能保持其活性。

Apalbumin 1、Apalbum in 2和 Apalbum in 3对储存温度不敏感,而 Apalbum in 4、Apalbum in 5和葡萄糖氧化酶对储存温度敏感,可作为王浆新鲜度评价指标的参考。

1 Chen C,Chen SY.Changes in p ro tein componen ts and storage stab ility of royal jelly under various conditions〔J〕.Food Chem,1995;54(2):195-200.

2 Kamakura M,Fukuda T,Fukushima M,et a l.Sto rage-dependent degradation of 57-kDa p rotein in royal jelly:a possib le marker for freshness〔J〕.BiosciBiotechno lBiochem,2001;65(2):277-84.

3 Zhong BX,Li JK,Lin JR,et a l.Possible effect of 30K p roteins in embryonic development of silkwo rm Bombyx mo ri〔J〕.Acta Biochim Biophys,2005;37(5):355-61.

4 Scarselli R,Donadio E,Giuffrida MG,et a l.Towards royal jelly p roteome〔J〕.Proteomics,2005;5(3):769-76.

5 苏松坤,陈盛禄 .意蜂王浆生产性能形态学遗传标记的研究〔J〕.遗传,2003;25(6):677-80.

6 Simuth J.Some p ropertiesof themain p rotein of honeybee royal jelly〔J〕.Ap idologie,2001;32(1):69-80.

7 Sano O,Kunikata T,Kohno K,et a l.Characterization of royal jelly p roteins in both africanized and european honeybees(Ap is mellifera)by two-dimensional gel electrophoresis〔J〕.J Agric Food Chem,2004;52(1):15-20.