一株海洋光合细菌D25的分离与鉴定

刘天华 李乐乐 乔梦等

摘要：从威海近海采得的海洋沉积物中经过富集培养和分离筛选，得到一株紫色菌落的海洋光合细菌，编号为Ｄ２５。利用梅里埃公司细菌鉴定系统对菌株的生理生化特征进行了检测，ＡＰＩ ２０Ｅ检测结果共有ＡＤＨ、ＣＩＴ等４项检测项目呈阳性，ＯＮＰＧ、ＬＤＣ等１６项检测项目呈阴性。经ＰＣＲ反应得到１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列，１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列测定和分析结果显示该菌株为嗜硫小红卵菌 （Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）。

关键词：海洋；光合细菌；１６Ｓ ｒＲＮＡ基因；生理生化

中图分类号：Ｑ９３－３３１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）16－3276-03

Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｄ２５

ＬＩＵ Ｔｉａｎ－ｈｕａ，ＬＩ Ｌｅ－ｌｅ，ＱＩＡＯ Ｍｅｎｇ，ＸＩＥ Ｆｅｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍａｒｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｔ Ｗｅｉｈａｉ，Ｗｅｉｈａｉ ２６４２０９， Ｓｈａｎｄｏｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｐｕｒｐｌｅ ｓｔｒａｉｎ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ ｎｕｍｂｅｒｅｄ Ｄ２５ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ＷｅｉＨａｉ ｏｆｆｓｈｏｒｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎ． Ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｄ２５ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｎｅｗ ＡＴＢ， ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＡＰＩ ２０Ｅ ｔｅｓｔ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ４ ｉｔｅｍｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｕｃｈ ａｓ ＡＤＨ ａｎｄ ＣＩＴ ，１６ ｉｔｅｍｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｌｉｋｅ ＯＮＰＧ ａｎｄ ＬＤＣ． Ｔｈｅ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＰＣＲ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｏｆ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆied ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ａｓ Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｍａｒｉｎｅ； ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ； １６Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ； ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ

光合细菌（Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ，ＰＳＢ），是一类在自然界中广泛存在的，能在厌氧条件下进行不放氧的光合作用并且能够利用光能自养生长，具有复杂代谢功能的细菌的总称。其具有固碳、固氮、脱氮、氧化硫化物等功能，是生命演化中的过渡类型，可作为光合作用机理和产氢固氮机理的研究材料［１－３］。由于光合细菌可以广泛利用多种有机物，具有在不同的条件下进行多种方式的生长代谢的特点，使其在有机废水处理中得以应用，和传统活性污泥法相比，利用光合细菌处理污水具有动力消耗低、脱氮除磷效果好、设备规模小、占地面积小、管理简易等明显优势［１］。此外，由于光合细菌具有净化水质和保护水环境的作用，加之其本身是活蛋白，营养丰富，在水产养殖方面可以促进生长，提高成活率和养殖效果，含有的抗病毒因子及多种免疫促进因子可活化机体的免疫系统，因此其在水产养殖方面也得到了广泛的应用［４］。对海洋沉积物中的一株光合细菌Ｄ２５进行分离并对其生理生化特性进行研究以及１６ＳｒＲＮＡ 基因序列的测定和分析，经鉴定该菌株为Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．的Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１海洋沉积物海洋沉积物由威海近海海域采得。

１．１．２培养基富集培养基：氯化铵１.0 ｇ，乙酸钠２.0 ｇ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０．２ ｇ，酵母膏０．２ ｇ，蛋白胨０．２ ｇ， ＥＤＴＡ １.0 ｇ，１ ０００ ｍＬ陈海水，ｐＨ值为７，灭菌后加入碳酸氢钠１.0 ｇ， 磷酸二氢钾０．２ ｇ。分离培养基：蛋白胨５.00 ｇ，酵母粉１.00 ｇ，柠檬酸铁０．０１ ｇ，琼脂１８.00 ｇ，陈海水１ ０００ ｍＬ，pＨ值为７。

１．２方法

１．２．１海洋光合细菌的富集取海洋沉积物约３ ｇ，置于盛满富集培养基的２５０ ｍＬ密闭富集培养瓶中，置于有恒定光源（２５Ｗ白炽灯泡）的恒温培养箱中在２８ ℃条件下富集培养３０ ｄ，至培养液呈红褐色时，富集结束。

１．２．２海洋光合细菌的分离对富集得到的培养液进行适当稀释后采用涂布法转接到分离培养基，恒温培养箱中２８ ℃恒温培养５ ｄ。选取紫色单菌落进行进一步的分离纯化培养，得到海洋光合细菌的纯培养菌株Ｄ２５。

１．２．３生理生化特性检测取一环分离纯化得到的纯培养菌株，通过划线的方法转接入分离培养基中２８ ℃恒温培养４８ ｈ。利用梅里埃公司细菌鉴定系统（ＡＰＩ ２０Ｅ鑒定试剂条）对菌株进行生理生化特征的检测与分析。

１．２．４１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列测定和分析［５－８］ 将菌株转接入分离培养基中于恒定光源的恒温培养箱中２８ ℃培养过夜。取一环单菌落悬浮于５０ μＬ无菌去离子水中，１００ ℃水浴加热５ ｍｉｎ，离心，取上清液作为ＰＣＲ模板ＤＮＡ。扩增正向引物２７Ｆ对应于Ｅ． ｃｏｉｌ １６ＳｒＤＮＡ序列的第８～２７个碱基位置，反向引物１４９２Ｒ对应于Ｅ． ｃｏｌｉ １６ＳｒＤＮＡ的第１４９２～１５１０个碱基位置，其序列分别为５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ（Ｃ／Ａ）ＴＧＧＣＴＣＡＧ－３′和５′－ＴＡＣＧＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡ

ＣＧＡＣＴＴ－３′。１０２．１０ μＬ ＰＣＲ反应体系组成为：１×ＰＣＲ缓冲液，１．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２，４×ｄＮＴＰ混合物各２００ μｍｏｌ／Ｌ，引物各０．５ μｍｏｌ／Ｌ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶

１ μＬ（５ Ｕ／μＬ），２ μＬＤＮＡ 原液。ＰＣＲ反应条件为：９６ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，５０ ℃复性1 ｍｉｎ，７２℃延伸２ ｍｉｎ，３０个循环；最后７２ ℃ 温育７ ｍｉｎ。ＰＣＲ扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，交由北京三博远志生物有限责任公司进行序列测定。

向ＧｅｎＢａｎｋ提交测得的基因序列，取得收录号。通过ＮＣＢＩ网站选取相似程度较高的序列利用ＭＥＧＡ（４．１）软件对其进行序列比较及系统发育分析，确定其种属及进化位置。

２结果与分析

２．１海洋光合细菌的分离筛选结果

通过富集培养，３０ d后观察到富集培养液变为红褐色，将富集培养液稀释，涂布于分离培养基，经过培养后再次划线分离得到1株纯培养光合细菌，编号为Ｄ２５。

在分离培养基上，２８ ℃恒温培养７２ ｈ，可观察到紫色、直径０．５～０．８ ｍｍ圆形、表面隆起、边缘整齐、不透明的菌落。经革兰氏染色鉴定其为革兰氏阴性菌。

２．２生理生化特性检测

利用梅里埃公司细菌鉴定系统对菌株的生理生化特征进行了检测，ＡＰＩ ２０Ｅ检测结果（表１）表明，共有ＡＤＨ、ＣＩＴ等４项检测项目呈阳性，ＯＮＰＧ、ＬＤＣ等１６项检测项目呈阴性。

２．２１６Ｓｒ ＲＮＡ基因序列测定与分析结果

通过琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，得到的目的片段长度约为１ ５００ ｂｐ。将得到的目的片段交由北京三博远志生物有限责任公司进行序列测定，得到核苷酸序列（图１）。向ＧｅｎＢａｎｋ提交测得的基因序列，取得收录号为ＨＱ２３４２９９。通过ＮＣＢＩ网站选取相似程度较高的序列，利用ＭＥＧＡ（４．１）软件对其进行序列比较及系统发育分析，确定其种属及进化位置。该菌株为Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．的嗜硫小红卵菌（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ），是一类能产氢的光合细菌，由此构建系统发育树（图２）。

３小结与讨论

２０世纪６０年代日本科学家小林正泰等［９］发现光合细菌在不同营养级的微生物群生态演替的过程中起着十分重要的作用，而该过程是高浓度有机废水在自然界得以自净的原因所在。采用光合细菌处理污水不仅能够降解简单的有机化合物，而且还能够降解较难处理的芳香化合物和卤代化合物，因此光合细菌处理污水具有较大的推广应用价值［１］。随着对光合细菌研究的深入，光合细菌作为一种具有特殊营养、促生长、抗病因子和高效率净化养殖污水及对环境和水产动物无毒无害的特殊细菌［４］，在水产养殖等领域中被逐渐得到了应用。

试验从海洋沉积物中分离筛选得到了海洋光合细菌Ｄ２５，通过ＰＣＲ技术扩增得到其１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列，经测序和比对，将其鉴定为Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．的Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｕｌｆｉｄｏｐｈｉｌｕｍ，由此构建系统发育树，确定了其亲缘进化关系。嗜硫小红卵菌是一种能利用还原性硫化物作为光合电子供体营光自养生长的嗜盐紫色非硫细菌，这种代谢的方式对净化海水、海产养殖地和高盐含硫废水的生物治理将具有重要意义。其菌体含有较为丰富的蛋白质和色素，可作为鱼类的开口饲料资源的重要来源，此外用其来培育轮虫等多种饵料生物，其所含有的营养物质可以通过食物链的关系间接供给水产养殖动物［１０］，因此菌株Ｄ２５在水产养殖方面也有着广泛的利用价值。

参考文献：

［１］ 周洪波，刘飞飞，邱冠周． 一株光合细菌的分离鉴定及污水处理能力研究［Ｊ］． 生态环境，２００６，１５（５）：９０１－９０４．

［２］ 谷志静，陈锡时，韩士杰，等． 海洋光合细菌Ｒｘ 菌株的分离鉴定与生物学特性研究［Ｊ］． 西北农林科技大学学报（自然科学版），２００４，３２（９）：７－５２．

［３］ 程新，涂晓嵘，魏赛金，等． 一株光合细菌的分离鉴定及其处理污水能力的研究［Ｊ］．安徽农业科学，２００９，３７（１０）：４３９１－４３９３．

［４］ 黄钧，陈琴，韦勇刚，等． 光合细菌在水产养殖上的应用概况［Ｊ］． 广西畜牧兽医，２００１，１７（１）：３９－４１．

［５］ 莫照兰，茅云翔，陈师勇，等． 一株牙鲆出血症病原菌的分子生物学鉴定［Ｊ］． 高技術通讯，２００１（１２）：１２－１７．

［６］ 李筠，颜显辉，陈吉祥，等． 养殖大菱鲆腹水病病原的研究［Ｊ］． 中国海洋大学学报，２００６，３６（４）：６４９－６５４．

［７］ ＫＵＭＡＲ Ｓ，ＴＡＭＵＲＡ Ｋ，ＮＥＩ Ｍ． ＭＥＧＡ３： Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００４，５：１５０－１６３．

［８］ 贾晶，张小葵，郑凯，等． 一株土壤琼胶降解菌ＱＭ６４ 的１６Ｓ ｒＤＮＡ 序列分析［Ｊ］．湖北农业科学，２００９，４８（８）：１８１１－１８１３．

［９］ 黄宝兴，李兰生，赵亮，等． 固定化海洋光合细菌处理生活污水的研究［Ｊ］．海洋湖沼通报，２００６（２）：６９－７４．

［１０］ 王绍校，杨惠芳，黄志勇，等． 嗜盐光合细菌的分离鉴定及其营养成分分析［Ｊ］． 应用与环境生物学报，２００３，９（３）：２９８－３０１．