羧甲基壳聚糖钙对小鼠CCl4造成的急性肝损伤的保护作用

2011-11-17蔡文娣初洪菊初金鑫付辰炜韩宝芹刘万顺

中国生化药物杂志 2011年1期

蔡文娣,初洪菊,初金鑫,付辰炜,韩宝芹,刘万顺

(1.潍坊医学院基础医学教学部,山东潍坊 261053;2.山东省平度市中医医院,山东平度 266700;3.中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛 266003)

羧甲基壳聚糖钙(carboxymethyl chitosan calcium,CCC)是以羧甲基壳聚糖为原料制备而成[1],具有预防性和治疗性排铅的功效[2-3],在实验过程中发现其在排铅的同时可能具有一定的抗氧化功效和肝保护作用。本研究建立了CCl4诱导的昆明小鼠的肝损伤膜型,通过测定血清中丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)的活性,肝脏中脂质过氧化程度,肝脏总抗氧能力(T-AOC),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),超氧化物歧化酶(SOD)等指标研究了CCC的抗氧化及肝保护功能。

1 材料

CCC,中国海洋大学海洋生命学院制备;CCl4,天津市大茂化学试剂厂;丙二醛(MDA)测定试剂盒、GSH-Px测定试剂盒、SOD测定试剂盒、T-AOC测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

雄性昆明小鼠(22～25 g),购自潍坊医学院动物中心,动物合格证号:SCXK(鲁)20050015。

TU-1800紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;Synchron CX-7生化测定仪,美国 Beckman有限公司。

2 方法

2.1 动物分组及给药

将小鼠随机分为5组,每组8只,分别为:正常对照组、CCl4模型组、CCC低、中、高剂量实验组,灌胃给予受试物。

对照组:每天给予相应体积的蒸馏水,20 d;CCl4损伤组:每天给予相应体积的蒸馏水,于第20天腹腔注射 CCl4(20mg/kg,用花生油稀释);CCC低、中、高剂量组:每天灌胃 CCC,剂量分别为0.125,0.25,0.5 g/(kg·d),于第20天末次给药 3 h后腹腔注射 CCl4(20mg/kg,用花生油稀释)。

小鼠经CCl4损伤 24 h后,摘眼球取血,分离得到血清,测定血清中 ALT、AST活性。同时断颈处死小鼠,取肝脏,称重,制得匀浆液。

2.2 血清中转氨酶活性的测定

AST、ALT活性在Synchron CX-7生化测定仪上进行测定。

2.3 T-AOC、MDA、GSH-Px、SOD的测定

肝匀浆中各项抗氧化指标的测定按照试剂盒中的操作方法进行。

2.4 肝匀浆中蛋白质含量的测定

肝匀浆中蛋白质的含量测定采用考马斯亮蓝法(Bradford法 )。

2.5 数据处理

所有数据采用单因素方差分析 (ANOVA),用最小显著差法(LSD法)检验作两两比较。

3 结果

3.1 血清中 AST、ALT活性

结果见表1。腹腔注射 CCl4能够诱导小鼠肝脏毒性,CCl4作用24 h后,血清中 AST、ALT含量与对照组相比分别升高了5.24和10.6倍,差异显著 (P＜0.05),造模成功。试验结果表明 CCC低、中、高剂量组都有效地降低了AST、ALT的活性(P＜0.05)。

表1 CCC对CCl4肝损伤小鼠ALT、AST活性和MDA含量的影响(n=8,±s)Tab.1 Influence of CCC on ALT,AST and MDA in CCl4-injured mice(n=8,±s)

与对照组比较:1P＜0.05;与肝损伤模型组比较:2 P＜0.051 P＜0.05 vs normal group;2P＜0.05 vsmodel group

组别剂量/(mg/kg) AST/(u/L) ALT/(u/L) MDA/(nmol/mg prot)正常对照组 - 161.02±20.57 57.81±4.96 0.93±0.23肝损伤模型组 - 843.31±118.601 614.11±30.9113.10±1.231 CC低剂量组 125 638.97±188.581,2 541.77±30.751,2 2.41±0.391,2 CCC中剂量组 250 645.25±125.661,2 420.77±48.981,2 2.07±0.501,2 CCC高剂量组 500 648.51±134.581,2 414.50±39.491,2 2.02±0.411,2

3.2 肝匀浆生物学指标测定结果

3.2.1 MDA测定结果如表1所示,CCl4肝损伤模型组的脂类过氧化产物——MDA的含量升高,差异显著(P＜0.05,与正常对照组相比),造模成功。CCC灌胃给药 20 d明显抑制了CCl4诱导的脂类过氧化,低、中、高剂量组都显著降低了肝脏中的MDA水平(P＜0.05,与模型组相比)。

3.2.2 SOD测定结果如表2所示,肝损伤模型组的SOD活性降低,与对照组相比差异显著(P＜0.05),CCC灌胃给药 20 d显著提升了肝脏中 SOD活性(P＜0.05,与模型组相比)。

3.2.3 GSH-Px测定结果如表2所示,肝损伤模型组的GSH-Px活性显著降低,与对照组相比差异显著 (P＜0.05)。CCC灌胃给药 20 d低、中、高剂量组都能提升 GSH-Px活性,但差异不具统计学意义。

3.2.4 T-AOC测定结果如表2所示,肝损伤模型组总抗氧化能力下降,与对照组相比差异显著(P＜0.05),CCC灌胃给药 20 d能显著提升 T-AOC水平(P＜0.05,与模型组相比)。

4 讨论

CCl4肝损伤模型是经典化学性肝损伤动物模型,CCl4进入体内后被肝脏微粒体细胞色素氧化酶P-450激活产生活泼的三氯甲基自由基,诱发脂质过氧化从而损害肝细胞的细胞膜,使内源性转氨酶释放到细胞外,导致血清中转氨酶活性显著升高[4]。

表2 CCC对CCl4肝损伤小鼠 SOD、GSH-Px和T-AOC的影响(n=8,±s)Tab.2 Influence of CCCon SOD,GSH-Px and T-AOCin CCl4-injured mice(n=8,±s)

与对照组比较:1P＜0.05;与肝损伤模型组比较:2 P＜0.051 P＜0.05 vs normal group;2P＜0.05 vs model group

组别剂量/(mg/kg)SOD/(u/mg prot) GSH-Px/(u/mg prot)T-AOC/(u/mg prot)正常对照组 - 81.23±7.52 160.86±4.04 2.39±0.18肝损伤模型组 - 43.85±8.311 131.63±9.751 1.10±0.161 CCC低剂量组 125 58.58±5.101,2 137.50±8.181 1.57±0.341,2 CCC中剂量组 250 67.27±5.401,2 139.50±10.061 1.82±0.421,2 CCC高剂量组 500 68.63±4.691,2 139.52±10.001 1.86±0.311,2

AST和ALT活性的高低能够反映细胞膜结构的完整性,本试验结果表明 CCC灌胃给药能够抑制CCl4诱导的血清中 AST和ALT活性的升高,提示CCC具有肝保护功能。

MDA是细胞膜脂质过氧化的主要降解产物,测定其含量可间接估计脂质过氧化程度[5]。实验结果表明 CCl4明显诱导肝脏中脂质过氧化,MDA含量升高,而CCC灌胃给药能够降低 MDA的含量,抑制脂质过氧化,提示 CCC具有肝保护功能。

机体抗氧化防御能力的强弱与健康程度存在密切联系,测定机体的总抗氧化能力具有重要意义。郑小丽等[6]的研究表明,总的抗氧化能力下降应该主要是抗超氧阴离子自由基的能力下降,对应的应是SOD酶的活力下降。很多研究表明 CCl4对肝的损伤可表现为参与氧化解毒的酶(SOD、GSH-Px)活性的下降。本试验结果与之相符,模型组总的抗氧化能力下降,SOD和GSH-Px酶的活力下降。提前灌胃给药能显著提高机体总抗氧化能力和SOD活性,提示 CCC是有效的抗氧化剂,能提高机体的防御机能。而GPH-Px的活力在模型组和实验组间无显著差异(P＞0.05),可能因为GSH-Px的活性中心是硒半胱氨酸,受试物对其不能起修复激活作用,具体机制有待深入研究。

总之,本研究结果表明,CCC对于CCl4造成的肝损伤具有一定预防功效,能够提高机体的抗氧化能力,为进一步研究开发提供了理论基础。

[1]蔡文娣,初金鑫,韩宝芹,等.羧甲基壳聚糖钙的制备及性质结构分析[J].潍坊医学院学报,2008,30(2):167-168.

[2]蔡文娣,韩宝芹,王常红,等.羧甲基壳聚糖钙对染铅小鼠排铅作用的初步研究[J].中华预防医学杂志,2006,40(6):415-418.

[3]初金鑫,韩宝芹,蔡文娣,等.羧甲基壳聚糖钙对染铅小鼠治疗性排铅作用的研究[J].中国海洋药物,2007,26(1):28-30.

[4]Palmes D,Spiegel H U.Animal models of liver regeneration[J].Biomaterials,2004,25(9):1601-1611.

[5]肖增平,吉爱国,宋淑亮,等.绞股蓝多糖对小鼠四氯化碳肝损伤的保护作用[J].中国生化药物杂志,2008,29(3):186-188.

[6]郑小丽,王风玲,范洪,等.检测Ⅱ型糖尿病患者总抗氧化能力的临床意义[J].现代诊断与治疗,1999,10(3):144-145.