真姬菇发酵海带废渣制备多糖的抗氧化活性

解秋菊，闫培生，池振明

（1.哈尔滨工业大学（威海）海洋学院，山东威海264209；2.中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003）

真姬菇发酵海带废渣制备多糖的抗氧化活性

解秋菊1，闫培生1，池振明2

（1.哈尔滨工业大学（威海）海洋学院，山东威海264209；2.中国海洋大学海洋生命学院，山东青岛266003）

利用试剂盒法测定了真姬菇液态发酵海带废渣后发酵上清液中多糖的抗氧化能力，结果表明，在多糖浓度为0.5mg/mL时，真姬菇31菌株发酵上清液中的多糖（简称31菌株多糖）对羟自由基的抑制率比海带废渣水溶液上清中的多糖（简称对照多糖）高了17.6%，对照多糖的IC50为1.94mg/mL，31菌株多糖的IC50为0.55mg/mL；多糖浓度为10mg/mL时，31菌株多糖对超氧阴离子自由基的抑制率比对照多糖高了14.6%；多糖浓度在0.6mg/mL时，31菌株多糖的总抗氧化能力比对照多糖高出了35.76%。通过实验可以得出：真姬菇发酵海带废渣后获得的多糖抗氧化活性比未发酵海带废渣中的多糖抗氧化活性显著提高，从而为海带废渣的高附加值再利用提供了科学依据。

真姬菇，液态发酵，海带废渣，多糖，抗氧化

海带废渣是在工业上用海带提取碘、甘露醇、褐藻酸钠后剩余的残渣，含有数十种矿物元素、脂肪和磷脂、有机酸、醛、酮、醇，单糖、双糖、淀粉、肝糖、菊糖、纤维素、果胶类物质（半纤维素）、单宁类物质、蛋白质和矿物质等。按干物质计，海带的工业利用率仅为30%，还有约2/3的海带成分尚未得到利用，不仅浪费了大量的自然资源，还带来一系列环境污染问题［1］。真姬菇，学名Hypsizigus marmoreus，又名玉蕈、斑玉蕈、海鲜菇、胶玉蘑、鸿喜菇、蟹味菇、假松茸等，是一种高营养价值、低热量、低脂肪的食品，具有良好保健功能［2］，其子实体提取物有抗自由基、抗氧化和延缓衰老等功效［3-5］。据报道［6-7］，真姬菇液体发酵所得食用菌菌丝体中的多糖含量远高于子实体，并且发酵液中含有大量的胞外多糖。利用真姬菇的生物学特性，对海带废渣进行液体发酵，研究和生产出新一代保健食品，极大地提高了海带废渣的高附加值，还可以消除污染，改善环境。本文研究了真姬菇液态发酵海带废渣发酵液上清多糖的抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羟自由基测定试剂盒、抗超氧阴离子自由基测试盒、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒 均购自南京建成生物工程研究所；海带废渣 荣成市寻山渔业公司；真姬菇31菌株 由本实验室筛选保存。

4K-15高速冷冻离心机 Sigma；Alpha1-2/LD-plus冷冻干燥机 Christ；MK3酶联免疫分析仪Thermo。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖的制备 将海带废渣磨成干粉，配制成7%的水溶液，同时添加0.2%的葡萄糖和0.09%的牛肉浸粉，pH自然，121℃灭菌30min。将真姬菇平板菌种打孔取块，接种于海带废渣液体培养基，25℃，110r/min恒温振荡培养，以不接种的海带废渣溶液作对照。12d后，将发酵产物4000r/min，10min离心，收集上清液，然后加入3倍体积的无水乙醇，混匀，4℃静置过夜后，5000r/min离心20min，沉淀用95%乙醇洗2次后，-20℃冷冻，冷冻干燥机中冻干，称重。

1.2.2 多糖清除羟自由基能力测定 将对照多糖、31菌株多糖分别用蒸馏水配制成0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、2.0、4.0mg/mL系列浓度，按试剂盒说明书提供的方法进行测定，每个浓度做三个平行，用酶标仪于550nm处测吸光度。

1.2.3 多糖清除超氧阴离子自由基能力测定 将对照多糖、31菌株多糖分别用蒸馏水配制成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0mg/mL系列浓度，按试剂盒说明书提供的方法进行测定，每个浓度做三个平行，用酶标仪于550nm处测吸光度。

1.2.4 多糖总抗氧化能力测定 将31菌株多糖和对照多糖分别用蒸馏水配制成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0mg/mL系列浓度，每个浓度做三个平行，用酶标仪于520nm处测吸光度，按试剂盒说明书提供的方法进行测定。

2 结果与分析

2.1 多糖清除羟自由基能力的比较

由图1可以看出，31菌株多糖清除羟基自由基的能力明显高于对照多糖，且抑制率随着多糖浓度的增大而增加。31菌株多糖在浓度为0.1～0.5mg/mL时其抑制率增加较慢，当大于0.5mg/mL时，抑制率从45.62%很快升至81.42%，在浓度为4mg/mL时抑制率达到85.79%，其IC50为0.55mg/mL。对照多糖的抑制率随着多糖浓度的升高逐渐增加，其 IC50为1.94mg/mL。对二者IC50做t检验(p＞0.05差异不显著；0.05＜p＜0.01差异显著；p＜0.01差异极其显著)，结果表明p＜0.01，差异极其显著。

图1 对照多糖、31菌株多糖的清除羟自由基测定结果

按照羟自由基试剂盒要求，抑制率在45%～55%之间所对应的浓度是样品的最佳浓度。通过实验结果得知，31菌株多糖在浓度为0.5mg/mL时，抑制率为45.60%，符合试剂盒要求，因此在该浓度下，比较对照多糖、31菌株多糖抗羟自由基能力，见图2。

从图2实验结果可以看出，加样量相同、多糖浓度相同的情况下，31菌株多糖对羟自由基的抑制率比对照多糖高出17.6%。对二者抑制率做t检验，p=0.0003，差异极其显著。

图2 对照多糖、31菌株多糖清除羟自由基和超氧阴离子自由基能力的比较

2.2 多糖清除超氧阴离子自由基能力的比较

由图3可以看出，31菌株多糖清除超氧阴离子自由基的能力高于对照多糖。31菌株多糖在低浓度范围内，抑制率随浓度的升高而增强，当多糖浓度从2mg/mL升至 10mg/mL时，抑制率增加较快，从6.32%升至26.77%，多糖浓度大于10mg/mL时，抑制率增加很慢，几乎接近于直线，在16mg/mL时，抑制率仅为28.63%。对照多糖对超氧阴离子自由基的抑制率随浓度的变化与31菌株多糖相似，但不明显。

图3 对照多糖、31菌株多糖的抗超氧阴离子自由基测定结果

从图3实验结果可以看出，多糖浓度为10mg/mL时，是抑制率快速增加的转折点，因此在该浓度下比较对照多糖、31菌株多糖清除超氧阴离子自由基能力，见图2。

从图2实验结果可以看出，加样量相同、多糖浓度相同的情况下，31菌株多糖对超氧阴离子自由基的抑制率比对照多糖高出14.6%。对二者抑制率做t检验，p＜0.01，差异极其显著。

2.3 多糖总抗氧化能力的比较

从图4实验结果可以看出，31菌株多糖的总抗氧化能力随多糖浓度的增加变化较大，在0.6mg/mL时总抗氧化能力达到最高，为2.164单位/mg多糖，当多糖浓度继续增加时，其总抗氧化能力则减少，至多糖浓度为6mg/mL时，总抗氧化能力减少为1.150单位/mg多糖；对照多糖的总抗氧化能力也表现出与31菌多糖相似的趋势，在多糖浓度为0.4～2mg/mL范围内，总抗氧化能力逐渐增加，当多糖浓度为2mg/mL时，总抗氧化能力达最高为1.811单位/mg多糖，多糖浓度继续增加时，总抗氧化能力则逐渐降低。多糖浓度在0.2～0.6mg/mL时，31菌株多糖的总抗氧化能力高于对照多糖，当大于0.8mg/mL时，31菌株多糖的总抗氧化能力低于对照多糖。多糖浓度在0.6mg/mL时（即31菌株多糖的总抗氧化能力达到最高），31菌株多糖的总抗氧化能力比对照多糖高出了35.76%。对二者最高抗氧化能力做t检验，p= 0.022，差异显著。

图4 对照多糖、31菌株多糖的总抗氧化能力测定结果

3 结论

本实验测定了真姬菇液态发酵海带废渣所得多糖的清除羟自由基、超氧阴离子自由基和总抗氧化能力，通过实验得出结论：真姬菇31菌株多糖清除羟自由基、清除超氧阴离子自由基和总抗氧化能力都比对照多糖的高，实验结果表明真姬菇对海带废渣的发酵有明显的效果。

4 讨论

食药用真菌多糖既可存在于真菌菌丝和子实体中，也可存在于发酵培养液中，对食药用真菌液体发酵胞外多糖的活性研究已成为开发食药用真菌的重要内容之一。叶明等［8］报道了随着黑芝发酵后胞外多糖浓度的增加，其对羟基自由基的清除能力逐渐增强，与本实验结果一致，但对羟自由基的抑制率在多糖浓度为40mg/mL时达到39.85%，低于本实验的结果（31菌株多糖在浓度为4mg/mL时，对羟自由基的抑制率为85.79%）。陈宏伟等［9］研究了蛹虫草胞外锌多糖的抗氧化能力，其对羟自由基和氧自由基的清除率都随多糖浓度的提高而增加，本实验结果与其一致，但其对羟自由基的IC50=1.63mg/mL，低于本实验的结果（31菌株多糖对羟自由基的IC50= 0.55mg/mL），其对氧自由基的IC50=4.97mg/mL，高于本实验的结果（31菌株多糖对超氧阴离子自由基的清除率最高达到28.63%）。

李顺峰等［10］报道真姬菇子实体多糖体外抗氧化特性研究表明，真姬菇子实体多糖粗品对超氧阴离子自由基有一定清除效果，在浓度为10mg/mL时抑制率达到最高，约30%左右，效果不太明显，本实验结果与其一致（31菌株多糖对超氧阴离子自由基的清除率在浓度为10mg/mL时为26.77%）；真姬菇子实体多糖粗品对羟自由基的清除率在5mg/mL左右时达到最高，为80%左右，清除能力较强，本实验结果与其一致（31菌株多糖对羟自由基的清除率在浓度为4mg/mL时为85.79%）。且在所选浓度范围内，两种清除能力都随着浓度升高而增加。本研究结果与该报道非常接近，表明真姬菇液体发酵海带废渣所得胞外多糖的抗氧化活性接近于真姬菇子实体多糖。

本实验用海带废渣作为培养基，液体培养真姬菇，实验结果证明，发酵液多糖的抗氧化活性明显提高，对真姬菇液体发酵的研究和海带废渣高附加值利用都有一定的意义，对于所得菌丝体多糖的活性有待进一步研究。

［1］汝少国，李永祺，白逢伟，等.崂山啤酒厂、海藻养殖化工厂污水对扁藻的生长效应［J］.海洋环境科学，1994，13（4）：56-62.

［2］上官舟建，林汝楷，张运茂.真姬菇生物学特性的研究［J］.食用菌学报，2004，11（4）：1-7.

［3］Lee Y L，Yen M T，Mau J L.Antioxidant properties of various extracts from Hypsizigus marmoreus［J］.Food Chemistry，2007，104（1）：1-9.

［4］Chang J S，Son J K，Li G，et al.Inhibition of cell cycle progression on HepG2 cells by hypsiziprenol A9，isolated from Hypsizigus marmoreus［J］.Cancer Letters，2004，212（1）：7-14.

［5］Ukawa Y，Ito H，Hisamatsu M.Antitumor effects of（1→3）-β -glucan and（1→6）-β-glucan purified from newly cultivated mushroom，Hatakeshimeji（Lyophyllum decates Sing.）［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2000，90（1）：98-104.

［6］董秀萍.液体种子种龄对姬松茸深层发酵的影响［J］.食品与发酵工业，2004，30（6）：59-63.

［7］王萍，师俊玲.真姬菇液体培养用菌种及其营养因子筛选［J］.食品与发酵工业，2008，34（3）：70-73.

［8］叶明，陈久山，杨柳，等.黑芝胞外多糖提取工艺条件优化及体外抗氧化活性研究［J］.食品科学，2009，30（8）：47-50.

［9］陈宏伟，陈安徽，邵颖，等.蛹虫草胞外锌多糖抗氧化能力的研究［J］.食品与发酵工业，2009，35（6）：54-57.

［10］李顺峰，张丽华，付娟妮.真姬菇子实体多糖体外抗氧化特性研究［J］.西北农业学报，2008，17（4）：302-305.

Antioxidant activity of exopolysaccharide from fermented kelp waste by Hypsizigus marmoreus

XIE Qiu-ju1，YAN Pei-sheng1，CHI Zhen-ming2
（1.School of the Ocean，Harbin Institute of Technology at Weihai，Weihai 264209，China；2.College of Marine Life Sciences，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The antioxidant activity of polysaccharides from the supernatant of fermentation by Hypsizigus marmoreus 31 with medium of kelp waste was detected by using the kit.The results showed that at the 0.5mg/mL，the inhibition rate of hydroxyl radical of the polysaccharide from fermentation supernatant was higher by 17.6% than from supernatant of solution of pure kelp waste in the same concentration，lC50of control experiment was 1.94mg/mL，while the lC50of polysaccharide from fermentation supernatant was 0.55mg/mL.At the 10mg/mL，the inhibition of superoxide anion was higher by 14.6%than from supernatant of solution of pure kelp waste in the same concentration.The totalantioxidantactivitywasincreased by 35.76% when the concentration of polysaccharide was 0.6mg/mL.The conclusion from the experiment was that the antioxidant capacity was increased evidently，and it was a scientific basis of the reusing of kelp waste with high value.

Hypsizigus marmoreus；liquid fermentation；kelp waste；polysaccharide；antioxidant activity

TS209

A

1002-0306（2011）02-0115-03

2010-10-28

解秋菊（1972-），女，本科，工程师，研究方向：食品微生物。