万米跑后外周血淋巴细胞凋亡及氧化应激的动态变化

许国喜

(燕山大学体育学院，河北秦皇岛 066004)

万米跑后外周血淋巴细胞凋亡及氧化应激的动态变化

许国喜

(燕山大学体育学院，河北秦皇岛 066004)

目的:观察万米跑后不同时相人体外周血淋巴细胞凋亡及血液中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)活性的变化，探讨大强度耐力运动后血液淋巴细胞凋亡的机制。方法:选取8名参加运动会万米长跑的体育专业男运动员，分别在运动前1天(RG)、运动后2h、24h和48h采血抗凝，分离淋巴细胞，用流式细胞仪检测血液淋巴细胞凋亡率，并测定血清中SOD活性、GSH和MDA含量。结果:运动后2h和24h外周血淋巴细胞凋亡率显著高于安静水平，2h显著高于24h;48h基本恢复安静水平。2h血浆中SOD酶活性、GSH和MDA含量均较安静水平显著升高;24h SOD和MDA仍显著高于安静水平，而GSH水平则无显著差异;48h后SOD、GSH和MDA均较安静水平无显著差异。外周血MDA含量与淋巴细胞凋亡率呈正相关(r:0．757;P:0.001)。结论:万米长跑对外周血淋巴细胞凋亡率有诱发效应，而凋亡率随时间的变化呈现“开窗理论”特征。运动引起的机体自由基代谢失衡可能是淋巴细胞凋亡率变化的原因之一。

淋巴细胞凋亡;氧化应激;外周血;万米跑

细胞凋亡是多细胞生物维持其完整性和自身稳定而在凋亡相关基因调控下发生的细胞程序性死亡方式，是机体维持其生理平衡的重要手段［1］。对免疫系统来说，机体淋巴细胞的凋亡率常常被作为判断机体免疫能力的一项重要指标［2］。研究认为，大强度急性运动时，由于应激激素的急剧增高，血液动力学发生急剧变化，导致淋巴细胞等免疫细胞快速动员入血，而在大强度运动后，淋巴细胞浓度降低，增值分化及活性降低，免疫球蛋白含量及功能也受到影响，出现免疫低下期，这一免疫低下期被 Pedersen称为“open windows”期［3］。动物实验表明，不良的外界刺激可以造成机体淋巴细胞凋亡率的改变，从而影响机体的免疫功能［4］。已有的研究认为大强度耐力运动和急性运动均可引起机体氧化应激，从而使自由基代谢失衡，危害机体。有学者通过动物实验发现过量运动可诱发淋巴细胞凋亡，降低机体免疫能力，加速衰老［5］。但人体大强度耐力运动后外周血淋巴细胞凋亡的时相性特征研究较少。本文采用流式细胞技术检测体育专业学生万米长跑运动后不同时相外周血淋巴细胞的凋亡情况，探讨大强度耐力运动后机体免疫能力低下的可能机制;同时通过测定通用的反映氧化应激水平的指标(SOD含量、GSH活性和MDA含量)，并对MDA的含量与淋巴细胞凋亡率进行了相关性检测，探讨人体外周血淋巴细胞凋亡率在运动后发生变化的可能机制。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

燕山大学参加运动会万米长跑的体育专业运动员8名，均为健康男性。

1.2 研究方法

1.2.1 血样采集 运动前1天、运动后2h、24h和48h分别采集受试者外周静脉血1ml，用500μL枸橼酸钠抗凝剂抗凝，取抗凝血1ml用于检测淋巴细胞凋亡，其余抗凝血立即冰冻离心机离心，为测定抗氧化酶与脂质过氧化水平备用。

1.2.2 血液淋巴细胞的提取和淋巴细胞凋亡率的检测 取抗凝血1ml，与Hank’s液1∶1混匀后，小心加入到2ml的细胞分离液之液面上，以2 000rpm(半径15cm水平转子) 15min，收集第二层细胞，放入含Hank’s液4ml的试管中，充分混匀后，以1 700rpm离心10min。吸去上清液，沉淀反复洗两次得到淋巴细胞。

收集5×105细胞，加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞;加入5μl的Annexinⅴ－FITC混匀后，加入5μl Propidium Iodide，混匀;室温、避光反应15min;在1h内过300目尼龙网上流式细胞仪检测。用标准品校准光路，保证仪器CV值小于3%，488nm激光激发，用FS和SS设门，确定淋巴细胞群，分别收集525nm、620nm波长的荧光，分析阳性细胞的百分率。

1.2.3 抗氧化酶与脂质过氧化水平的测定 SOD活性、MDA含量和GSH水平测定均严格按照试剂盒提供的说明书操作。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要仪器和试剂

枸橼酸钠抗凝剂、淋巴细胞分离液购于天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，Annexinⅴ－FITC双染色试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司，TDZ4－WS低速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)，EPICSXL型流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)，ECOM－F6124型半自动生化分析仪(德国EPPENDORF公司)。

1.4 数理统计

用SPSS 15.0软件对所获得数据进行处理，选择1－SampleK－S进行正态检验，选择One－Way ANOVA进行单因素方差分析，用mean±SD表示结果。用P＜0.05来表示数据差异具有显著性。

2 结果

2.1 受试者的基本情况 见表1。

2.2 万米长跑后人体外周血淋巴细胞凋亡率的变化

与安静状态比较，运动后2h和24h血浆淋巴细胞凋亡率显著升高(P＜0.01)，运动后2h显著高于24h(P＜0.05)，48h基本恢复安静水平，人体血浆淋巴细胞凋亡率在万米长跑后的时序性变化特征见图1;从血浆淋巴细胞凋亡的流式细胞仪分析图(图2)也可以看出同样的趋势。

表1 受试者基本情况一览表

图1 万米跑后人体外周血淋巴细胞凋亡率的时相变化

图2 血液淋巴细胞凋亡流式细胞仪分析图

2.3 万米长跑后人体外周血中SOD酶活性、GSH与MDA含量的变化

运动前安静时相比，万米长跑后2h和24h人体血浆中SOD酶活性显著升高(P＜0.01)，运动后48h则五显著变化(P＞0.05);与运动后24h相比，运动后48h人体血浆中SOD酶活性显著下降(P＜0.05)。运动前安静水平相比GSH水平在运动后2h显著高升高(P＜0.05)，而运动后24h和48h则无显著差异(P＞0.05)。与运动前安静水平相比，MDA含量在运动后2h和24h均显著升高(P＜0.01)，而运动后48h则无显著差异(P＞0.05);与运动后24h相比，运动后2h显著升高(P＜0.01)。运动前后血浆中SOD酶活性、GSH与MDA含量的时相变化见图3、图4、图5。

2.4 万米长跑后人体外周血淋巴细胞凋亡率与MDA含量的相关性

如图6所示，万米长跑后人体血浆MDA含量与淋巴细胞凋亡率呈正相关关系，有统计学意义(r:0.757;P:0.001)。

图3 万米跑后人体血浆中SOD的变化

图5 万米跑后人体外周血中MDA的变化

图4 万米跑后人体外周血中GSH的变化

图6 人体外周血MDA含量与淋巴细胞凋亡率相关性检验

3 讨论

细胞凋亡的概念在1972年由澳大利亚病理学家Kerr等首次提出［1］。近年来随着细胞生物学和分子生物学的发展，细胞凋亡的研究已经成为现代医学和生物学研究领域中的热点。细胞凋亡是一种具有特征形态和生化改变的细胞死亡过程，其意义在于多细胞生物通过这种特殊的细胞自杀行为对不同外界有害刺激时产生应答，从而维持内环境的平衡和生长发育，细胞凋亡持续发生在机体整个生命过程［6］。运动作为一种外在刺激，势必会影响机体内环境的稳定，近年来的研究表明，多种运动方式都可能引起机体的细胞凋亡率，而凋亡率变化也发生在多种组织细胞，比较普遍的观点有急性、大强度运动能引起多种组织细胞的凋亡率上升，其中包括免疫细胞［5］。MoorenFC等证实在力竭运动后血淋巴细胞数目下降［7］。近年来，国内外学者也相继发现力竭运动后胸腺细胞血淋巴细胞凋亡率显著增加，认为这可能是导致力竭运动后免疫功能低下的主要原因［8］。

李靖等人对大鼠进行一次性力竭游泳训练，发现一次性力竭运动能够诱导大鼠淋巴细胞凋亡，且随着疲劳加深凋亡细胞比例增大［4］。本研究发现，万米长跑后，人体外周血淋巴细胞凋亡率增加，这与前人的研究是相一致的，而淋巴细胞凋亡增加可能是免疫功能低下的原因之一;本研究还发现万米长跑后人体外周血淋巴细胞凋亡也呈现时相性特征，运动后2h和24h人体外周血淋巴细胞凋亡率显著高于运动前安静水平(P＜0.01)，运动后2h高于24h(P＜0.05)，48h基本恢复。在运动影响血液淋巴细胞凋亡率方面，其他学者也有相关报道，认为运动会导致运动后血液中淋巴细胞的减少，Morren通过选取健康志愿者，并对他们进行力竭性运动实验发现，力竭运动后即刻血液中的淋巴细胞凋亡率呈显著性增长［7］。Mars等进行力竭性跑步运动实验，在运动后即刻、24h和48h取静脉血，用TUNEL法染色志愿者的淋巴细胞，并采用流式细胞术对凋亡率进行检测，与运动前的相比，发现运动后即刻有63%的淋巴细胞、运动后24h有86.2%的淋巴细胞出现凋亡［9］。Umegaki等让志愿者在跑台上以85%VO2max的强度运动30min，发现发生轻微的染色体损伤，而这种损伤能在次级氧化应急的诱导下加强［10］。刘晓莉等人通过DNA损伤检测实验也间接说明了大强度耐力运动对细胞凋亡的影响及其时序性［11］。而这种时序性特征也被国外不少学者的研究证实［12－13］。这些研究均直接或间接地证明了大强度耐力运动对机体外周血淋巴细胞的凋亡有诱发作用，从而在一定程度上解释了长时间大强度运动后机体外周血淋巴细胞数量的减少。而大强度耐力运动后引起细胞的凋亡具有一定的时序性，与本研究的时序性特征具有一致性。与Pedersen的“Open Windows”理论也具有对应性。表明机体在大强度耐力运动后，免疫能力会大大降低，而这个低下期可能持续24h左右。但也有研究认为运动后淋巴细胞数量减少并不是由淋巴细胞凋亡产生的，但大强度耐力运动后机体免疫能力的下降得到了诸多学者的公认。

机体在有氧代谢过程中产生活性氧族(reactive oxygen species，ROS)，正常情况下，机体内ROS的产生和消除系统处于动态平衡状态，但这种平衡状态很容易被外界的刺激打破，从而导致ROS代谢失衡，ROS对机体产生损害作用，反映到机体就会出现氧化应激(oxidative stress)，SOD酶活性、GSH水平常用来作为反映机体的抗氧化能力，MDA作为脂质过氧化的产物其含量经常可以间接代表组织发生氧化损伤的程度。研究认为大强度耐力运动会使机体组织缺血、缺氧、ATP分解加速，使得cAMP生成增加，在黄嘌呤氧化酶作用下产生超氧阴离子自由基，同时线粒体呼吸链电子传递加快，使呼吸链产生大量的自由基，从而使机体的抗氧化系统被打破，大量的自由基攻击细胞膜，造成细胞凋亡［14－15］。本实验结果表明，万米长跑运动后2h和24h，人体外周血中SOD酶活性与运动前水平相比显著升高，GSH水平在运动后2h与运动前水平相比显著升高，这可能是机体加快自由基清除的代偿性反应，而对应的脂质过氧化产物MDA的含量发生显著变化。万米长跑运动引起体内ROS自由基生成增多，导致运动性氧应激和膜脂质过氧化，而已有的研究认为，氧化应激造成的细胞凋亡与自由基诱导细胞膜上的凋亡相关蛋白表达有关，自由基诱导细胞膜凋亡通路打开［16］。机体因ROS自由基的失衡造成内环境的稳态一旦被打破，再次恢复平衡需要一定的时间，因此在运动后24h时血液仍保持较高的氧化应激水平。随着时间的增加，机体的ROS自由基的清除，机体抗氧化系统恢复到平衡状态。而从机体MDA含量与淋巴细胞凋亡的相关性(r:0.757;P:0.001)可以看出，机体在大强度耐力运动后，外周血淋巴细胞凋亡的可能与大强度耐力运动产生大量的氧自由基有关。可以推断，机体在大强度耐力运动的Open Windows与大量自由基的产生有很大关系。当然，运动后淋巴细胞的凋亡程度也会随着运动方式、运动量以及组织器官的不同而有差异性［3］，所以目前来看，有关大强度运动引起淋巴细胞凋亡时序性的研究结果还存在差异性，详细而准确的时序结论还需要更多的实验验证。

4 结论

万米长跑对外周血淋巴细胞凋亡率有诱发效应，运动后凋亡率随时间的变化呈现“开窗理论”特征。万米长跑后外周血淋巴细胞凋亡率的增加可能是机体免疫能力下降的原因。大强度耐力运动引起的机体自由基代谢失衡可能是淋巴细胞凋亡率变化的原因之一。

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Effect of Lymphocytes Apoptosis and Oxidative Stress on Human Peripheral Blood Induced by 10 000meter Running

XU Guoxi
(Department of PE，Yanshan University，Qinhuangdao 066004，Hebei，China)

object:we investigated the lymphocytes apoptosis and the level of anti-oxidative status on human serum in different times after ten-thousand-meter running，and discussed the mechanism of lymphocytes apoptosis induced by endurance exercise．Method:We selected eight healthy male athletes，who participated in ten-thousand meter running in sports games．The subjects were tested twenty-four hours before exercise and 2 hours，24hours and 48 hours after exercise．We investigated the lymphocytes apoptosis on human peripheral blood by flow cytometry and detected the level of SOD，GSH and MDA in serum．Results:The results have showed that the lymphocytes apoptosis on peripheral blood cell significantly increased 2h and 24h after exercise and 2h it was significant higher than 24h．It reduced to the level of pre-exercise after 48 hours．The activity of SOD and the content of GSH and MDA in serum increased significantly at 2h compared with the pre-exercise，and SOD activity and MDA content were still significant higher than the pre-exercise．The changes of the indexes in serum at 48h had no significant difference compared with pre-exercise．A negative correlation was found between MDA and the rate of lymphocyte apoptosis．Conclusions:ten-thousand-meter running induces have effects on rates of peripheral blood lymphocytes，and the apoptosis rate changes over time show“open windows”feature．Exercise-induced metabolic imbalance of free radicals might be one of the lymphocytes apoptosis mechanisms．

lymphocytes apoptosis;oxidative stress;peripheral blood;ten-thousand-meter running

G804.7

A

1004－0560(2011)04－0086－04

2011-05-12;

2011-06-19

河北省科技厅资助项目(11457201D－10)。

许国喜(1963－)，男，副教授，学士，主要研究方向为学校体育与健康。

责任编辑:乔艳春

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