四黄汤对急性肝损伤小鼠保护作用的研究

苏治合，温 飞，蔡 栩，孙智娟，尹 娇，秦 燕

（1.大理学院临床医学院，云南大理 671000；（2.大理学院基础医学院，云南大理 671000）

四黄汤对急性肝损伤小鼠保护作用的研究

苏治合1，温 飞1，蔡 栩1，孙智娟1，尹 娇1，秦 燕2*

（1.大理学院临床医学院，云南大理 671000；（2.大理学院基础医学院，云南大理 671000）

目的：探讨四黄汤对小鼠急性肝损伤的保护作用。方法：将60只小鼠随机分为四组，正常对照组15只、模型组15只、四黄汤高剂量组15只（40 g/kg/d生药）及四黄汤低剂量组15只（20 g/kg/d生药）。模型组每天灌以相同容积的生理盐水,连续2周。最后一次灌胃24 h后，除正常对照组外,所有小鼠以CCl（40.1%10 mL/kg）腹腔注射，禁食不禁水8 h后断头取血及肝脏，检测血清谷丙转氨酶（ALT）的活性；部分肝组织制备肝匀浆，检测丙二醛（MDA）的含量，同时取相同部位的肝组织制备病理切片，观察小鼠肝组织损伤的程度。结果：急性肝损伤模型组血清ALT的含量明显高于正常对照组（P＜0.05）；四黄汤低剂量干预组血清ALT的含量则低于模型组（P＜0.05），而高剂量干预组血清ALT含量则较模型组偏高（P＜0.05）；模型组肝组织MDA含量高于正常对照组（P＜0.05）；四黄汤低剂量及高剂量干预组肝组织MDA的含量低于模型组（P＜0.05）。光镜下四黄汤低剂量干预组肝细胞损伤程度较急性肝损伤模型组减轻。结论：四黄汤对小鼠的急性肝损伤具有一定的保护作用。

四黄汤；急性肝损伤；保护作用

急性肝损伤是多种肝病发生、发展，最终走向肝功能衰竭的始动环节和共同途径，深入研究其发病机制及防治新思路对临床治疗肝损伤具有重要的指导意义。肝损伤的发生与肝细胞膜改变，自由基生成过多和脂质过氧化有着密切联系〔1-2〕。传统中药方剂四黄汤由黄芩、黄连、黄芪、生地黄等10味药材组成。黄连、黄芩、黄芪具有疏肝解毒，攻积导滞、活血止血、滋阴补肝、息风等之功效〔3〕。故本研究通过建立急性肝损伤的小鼠模型，观察四黄汤对急性肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）活性，肝组织丙二醛（MDA）含量以及肝细胞损伤的保护作用，初步阐明四黄汤对急性肝损伤的保护机制，为四黄汤的临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物与主要试剂 四黄汤由生地黄、黄芩、黄芪、黄连等10味中药组成，生药均购自大理市东骏大药房，煎煮后过滤、浓缩，置4℃冰箱备用。0.1%四氯化碳（CCl4）购自成都市智远化工贸易有限公司，谷丙转氨酶（ALT）测定试剂盒、丙二醛（MDA）测定试剂盒和考马斯亮兰蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物及分组 健康雌性昆明小鼠，3～4月龄，共60只，由大理学院实验动物房提供。随机分为4组，每组15只。其中模型组给予生理盐水（0.2 mL/10g）灌胃；四黄汤低剂量组：每天灌胃0.2 mL/ 10g（含1 g/mL生药）；高剂量组：每天灌胃0.2 mL/ 10g（含2 g/mL生药），持续2周。最后一次灌药24 h后，0.1%CCl4溶液行腹腔注射（0.1 mL/10g）。禁食不禁水8 h后断头取血及取肝脏，检测血清ALT的活性；部分肝组织制备肝匀浆，检测MDA含量。

1.3 主要仪器 RE5002（50 L）旋转蒸发仪（上海卫凯仪器设备有限公司）；JY88-Ⅱ超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）；TGL-18R（珠海黑马医学仪器有限公司）；电子分析天平CVA214C（奥豪斯仪器上海有限公司）；电子制冰机Barline BF320（斯科茨曼制冰系统上海有限公司）。

1.4 病理切片 用10%中性福尔马林固定肝组织，常规石蜡包埋，制成石蜡切片。HE染色，观察肝组织的形态学改变。

1.5 统计学分析 全部数据均用单因素方差分析在SPSS13.0统计软件中进行处理，结果用（±s）表示。

2 结果

2.1 四黄汤对急性肝损伤小鼠血清ALT及肝组织MDA含量的影响 实验结果显示，急性肝损伤模型组血清ALT的含量明显高于正常对照组（P＜0.05）；四黄汤低剂量干预组血清ALT的含量则低于模型组（P＜0.05），而高剂量干预组血清ALT含量则较模型组偏高（P＜0.05）；模型组肝组织MDA含量高于正常对照组（P＜0.05）；四黄汤低剂量及高剂量干预组肝组织MDA的含量低于模型组（P＜0.05）。见表1。

表1 各实验组小鼠血清ALT、肝组织丙二醛（MDA）含量的变化（±s，n=15）

表1 各实验组小鼠血清ALT、肝组织丙二醛（MDA）含量的变化（±s，n=15）

注：与正常对照组比较：☆P＜0.05，与模型组比较：◆P＜0.05。

2.2 肝组织形态学改变 正常对照组肝小叶形态正常，肝细胞形态正常（见图1）。急性肝损伤模型组可见肝小叶内大量炎性细胞浸润，其中以淋巴细胞浸润为主，肝细胞水肿（见图2）。四黄汤低剂量干预组见肝小叶内淋巴细胞浸润，与模型组相比炎性细胞浸润数量明显减少，仍可见肝细胞水肿（见图3）。高剂量干预组肝细胞水肿较为明显，中央静脉周围可见片状肝细胞坏死，炎细胞渗出不明显（见图4）。

图1 正常对照组（HE×200）

图2 模型组（HE×200）

图3 低剂量干预组（HE×200）

图4 高剂量干预组（HE×200）

3 讨论：

CCl4诱导的急性肝损伤模型是传统的肝毒模型〔4〕。CCl4诱导急性肝损伤的机制与自由基生成及其启动的脂质过氧化连锁反应等有关。CCl4经肝细胞内质网中的细胞色素氧化酶P450代谢分解产生三氯甲烷超氧自由基（CCl3O2-），CCl3O2-攻击膜上的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，生成大量的脂质过氧化产物，导致膜的流动性和通透性改变，破坏细胞膜的结构和完整性，引起细胞膜结构和功能损害〔5-7〕。

肝细胞损伤时，细胞膜通透性增加，ALT释放入血，故血清中ALT含量在一定程度上反映了肝细胞受损程度，是反映肝损伤的敏感且最常用的指标〔8〕。MDA是脂质过氧化的最终产物，可严重破坏细胞膜结构，导致细胞肿胀、坏死，含量高低可反应氧化的损伤程度〔9〕。本研究结果显示模型组小鼠血清ALT的含量明显升高，提示模型组小鼠肝细胞膜的结构受到损害，膜通透性明显增加。与此同时肝组织MDA的水平也明显升高，说明CCl4在体内引发一定量的氧自由基和一定程度的脂质过氧化反应。低剂量四黄汤干预组小鼠，其血清ALT的水平较模型组明显降低，而高剂量干预组小鼠血清ALT含量与模型组相比，数值反而升高，二者具有统计学有意义（P＜0.05），说明一定量的四黄汤对急性肝损伤小鼠的肝细胞具有保护作用，但药物剂量过大，可能对肝细胞产生毒性作用，使肝细胞的损伤进一步加重。模型组肝组织MDA含量高于正常对照组；而低、高剂量四黄汤干预后发现，两组均使小鼠肝组织的MDA含量明显降低。肝组织病理改变也表明四黄汤干预后的肝组织形态学异常改变较模型组减轻，且炎症细胞浸润也明显减少。上述结果提示一定剂量的四黄汤可能通过提高机体抗氧化能力减轻脂质过氧化反应、稳定肝细胞膜等途径，发挥对小鼠急性肝损伤的保护作用。但药物剂量过大，则对小鼠肝脏有损害作用，这可能与四黄汤内复杂的化学成分有关。因此，四黄汤对肝脏的作用实际是一把“双刃剑”，有利有弊，如何正确把握剂量，使其扬长避短，更好地服务于临床，还有待进一步的研究。

〔1〕张锦雀，黄丽英.肝损伤动物模型的研究进展〔J〕.福建医科大学学报，2009，43（1）：86-88.

〔2〕沈洪，张蓓.急性肝损伤研究进展〔J〕.现代中西医结合杂志，2009，18（18）：2211-2213.

〔3〕凌一揆.中药学〔M〕.上海：上海科技出版社，1984，212-246.

〔4〕方清茂，张浩，曹毓.藏药波棱瓜子提取物对肝损伤大鼠的抗氧化作用〔J〕.华西药学杂志，2008，23（2）：147-149.

〔5〕Melin A M，Perromat A，Deleris G.Pharmacologic application of Fourier transform IR spectroscopy：in vivo toxicity of carbon tetrachloride on rat liver〔J〕.Biopolymers，2000，57（3）：160-168.

〔6〕Pramyothin P，Janthasoot W，PongnimitprasertN，et al. Hepatotoxin effect o（f+）usnic acid from Usnea siamensis Wainio in rats，isolated rat hepatocytes and isolated rat liver mitochondria〔J〕.J Ethnopharmacol，2004，90（2-3）：381-387.

〔7〕刘丹卓，赵新广.肝损伤病因病理机制及中医药治疗研究近况〔J〕.国医论坛，2006，21（6）：53-55.

〔8〕李义奎.中药药理实验方法学〔M〕.上海：上海科学技术出版社，1991.

〔9〕张学武，朴龙，刘超，等.珍珠梅水提物对大鼠肝损伤的保护作用〔J〕.世界华人消化杂志，2003，11（10）：1497-1499.

Protective Effect of Sihuangtang on Acute Hepatic Injury in Mice

SU Zhihe1,WEN Fei1,CAI Xu1,SUN Zhijuan1,YIN Jiao1,QIN Yan2*
（1.School of Clincal Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China; 2.School of Basic Medicine,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To investigate the protective effect of Sihuangtang on acute hepatic injury in mice and its mechanism. Methods:Sixty mice were randomly divided into 4 groups each with 15,normal control group,model group,Sihuangtang high-dose group(40 g/kg/d crude),and Sihuangtang low-dose group(20 g/kg/d crude).Drug administration was conducted with gastric lavage in different dose everyday for 2 weeks in two treated groups,the same volume of normal saline was applied for model group.Twenty four hours after last gastric lavage,except normal control group,all mice were fasting for 8 hours and then euthanized with intraperitoneal injection of CCl4(0.1%10 mL/kilogram).The levels of alanine aminotransferase(ALT)in the serum,and malonaldehyde(MDA)in the liver were determined.And the pathological examination of liver tissue was observed by optical microscope.Results:The MDA level in the liver and the content of ALT in the serum of acute hepatic injury model group were significant higher than those in normal control group(P＜0.05);compared with the acute hepatic injury model group,the MDA levels in the liver in Sihuangtang low-dose and high-dosage group were both evidently decreased (P＜0.05);and the content of ALT in the serum of Sihuangtang low-dosage group was evidently decreased compared with the model group (P＜0.05),but the content of ALT in the serum increases in Sihuangtang high-dose group compared with the model group (P＜0.05).Under the optical microscope,liver cell injury of the low dose group was evidently slighter than that of the model group.Conclusion:Sihuangtang in certain concentration has protective effecton acute hepatic injury in mice.

Sihuangtang;acute hepatic injury;protective effect

R333.4［文献标志码］A［文章编号］1672-2345（2011）12-0044-03

大理学院大学生科研基金资助项目（KYSX2010-089）。

2011-06-01

苏治合，2007级临床医学专业本科生.

*通信作者：秦燕，副教授.

（责任编辑 董 杰）