近红外漫反射光谱法快速测定黄芩药材中黄芩苷和汉黄芩苷含量

潘建超薛东升 刘绍勇

（上海凯宝药业股份有限公司，上海 201401）

近红外漫反射光谱法快速测定黄芩药材中黄芩苷和汉黄芩苷含量

潘建超*薛东升 刘绍勇

（上海凯宝药业股份有限公司，上海 201401）

目的针对中药生产中药材质量控制的问题，运用近红外漫反射光谱技术，结合化学计量学，提出一种快速测定黄芩药材中黄芩苷和汉黄芩苷含量的方法。方法利用HPLC法测定黄芩药材中黄芩苷和汉黄芩苷的含量作为对照值，运用偏最小二乘回归（PLS）建立黄芩药材近红外光谱与HPLC法含量测定值之间的多元校正模型，并对未知样本进行预测。结果黄芩苷和汉黄芩苷校正模型的相关系数分别为0.995、0.969，交叉验证误差均方根RMSECV分别为0.678、0.143，验证集预测误差均方根RMSEP分别为0.602、0.221。结论该方法可实现对黄芩药材的快速分析，预测结果准确可靠，可推广用于其他中药材的质量控制。

近红外漫反射光谱；黄芩；偏最小二乘；药材质量控制

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清热燥湿，泻火解毒等功效，其化学成分主要为黄酮类物质，如黄芩苷、汉黄芩苷等[1]，是黄芩药材质量控制的重要指标。常用的黄芩药材分析方法有高效液相色谱法、紫外分光光度法等[2,3]，但上述方法操作繁琐，分析耗时长，不适合用于中药生产中大批量药材的快速分析。近年来，近红外光谱技术以其快速、稳定和无污染等优势在烟草、制药、食品等领域发挥着重要的作用[4-6]，本研究采用近红外漫反射光谱技术，实现了对黄芩药材中黄芩苷和汉黄芩苷含量的快速分析，为黄芩药材的质量控制提供了新方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

Antaris傅里叶变换NIR光谱仪（Thermo Nicolet Corporation，USA），仪器配有Result 3.0B光谱采集软件；Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；MILLIPORE超纯水器（美国Millipore公司）；METTLER AE240电子天平（梅特勒－托利多上海有限公司）；FL-027高速台式离心机（德国Eppendorf公司），数据处理采用TQ Analyst 8.0和Matlab数据处理软件。

1.2 试剂及样品

实验用甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，实验用水为超纯水。黄芩苷（110715-200514）、汉黄芩苷（080612）购自中国药品生物制品检定所。

实验所用的黄芩样品中30批由上海凯宝药业有限公司提供，5批购于杭州市各大药房。以上35批黄芩药材由于产地不同，其成分含量不均匀，为使样本中各成分含量分布范围更加均匀，将35批黄芩药材按照不同比例进行混合，得到47批实验室自制黄芩药材粉末，共82批黄芩粉末样品。

2 方法与结果

2.1 样品预处理

将黄芩药材粉碎，过60目筛，过筛后的粉末置于烘箱中，60℃下干燥10h，将干燥后的黄芩粉末密封保存于干燥器中。

2.2 HPLC分析

色谱条件：色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：A相：0.2%甲酸-水，B相：0.2%甲酸-乙腈，梯度洗脱程序为：0～10min，A相85%～70%；10～18min，A相70%～65%；18～24min，A相65%～65%；24～30min，A相65%～40%；30～31min，A相40%～1%；31～36min，A相1%～1%；流速：1mL/min；柱温：40℃；检测波长：276nm；进样量：5μL。

精密称取黄芩药材粉末10mg于5mL量瓶中，加提取溶剂（甲醇∶水∶甲酸＝70∶29∶1）超声提取45min后，定容至刻度，摇匀，12000r/min离心10min，取上清液作为供试品溶液，进行HPLC分析。

2.3 近红外光谱扫描条件

光谱采集条件：采用积分球漫反射法采集黄芩药材粉末的近红外光谱图。光谱采集波长范围：4000～10000cm-1，分辨率：4.0cm-1，增益：2x，衰减：Empty，扫描次数：64次。见图1。

图1 黄芩药材粉末的近红外漫反射光谱图

2.4 运用PLS法建立多元校正模型

选择合适的建模波段，并对光谱进行适当的预处理，采用偏最小二乘回归（PLS）建立黄芩药材粉末近红外光谱与黄芩苷、汉黄芩苷HPLC含量测定值之间的多元校正模型。以交叉验证误差均方根（RMSECV）为指标，采用留一法交叉验证确定建模最佳主成分数。模型对校正集样本和验证集样本的预测误差分别用校正集预测误差均方根（RMSEC）和验证集预测误差均方根（RMSEP）来考核。

3 讨 论

3.1 样本异常点的剔除及分类

在近红外光谱扫描过程中，由于光谱仪系统误差、样品性质差异较大等因素，可能出现异常光谱，这些异常光谱加入模型会影响模型的预测精度。本研究通过计算每个样品近红外光谱与平均光谱的马氏距离，经过Chauvenet 检验，发现有2个异常光谱，将这两个样品剔除，剩余的80份样品用来建模。为了使校正集样本更具有代表性，同时在一定程度上避免校正集样本分布不均匀，本研究采用Kennard–Stone（KS）分类法对样本进行分类，将80份黄芩样品分成2类，校正集样本60个，验证集样本20个。

3.2 黄芩样品含量测定结果（%）

将黄芩药材粉末按照2.2项下样品预处理方法进行处理，并进行HPLC分析，分别得到校正集和验证集样品中黄芩苷和汉黄芩苷的含量分布范围，见表1。

表1 黄芩苷和汉黄芩苷的含量分布范围（%）

3.3 不同的光谱采集方式对模型性能的影响

本研究比较了两种不同的光谱采集方式对模型预测性能的影响。分别采用积分球漫反射法和光纤探针漫反射法采集全部黄芩样品的近红外光谱图，运用相同的建模波段和光谱预处理方法进行建模，分别得到黄芩苷和汉黄芩苷含量测定的校正模型，并对验证集中20份样品进行含量预测，比较两种不同的光谱采集方式所得模型的性能参数，结果见表2，由结果可知，采用积分球漫反射法所得的模型性能参数均优于光纤探针漫反射法，对验证集样品的预测准确率较高，这可能是由于采用积分球漫反射法采集光谱时，样品填充的松紧程度比较均一，减小了粒径不均对光程的影响，且采集过程中样品杯的匀速转动可以采集到不同位置样品的光谱信息，得到的光谱信息更加准确可靠。

表2 不同光谱采集方式所得模型性能参数

表3 不同光谱预处理方法所得模型参数比较

3.4 建模波段的选择

运用PLS方法建模时，建模前对光谱波段进行筛选，可以更好地提取光谱中的有效信息，改善模型性能，提高计算速度。本研究采用相关系数法和方差图谱来筛选建模波段。相关系数法是将校正集光谱的每个波长点对应的吸收值与浓度值进行相关性计算，得到波长与相关系数之间的相关图，相关系数越大的波段，包含的样品信息越多。图2显示了每个波长点的相关系数图，可以看出在4000～6200cm-1范围的相关系数值较大，基本在0.50以上。方差图谱是指所有样品在每个波长点吸收值的方差图，它反映了样品在每个波长点吸收值的变化情况，方差大的波长点包含的信息较丰富，更能体现样品之间的差别。图3显示的是所有样品在每个波长点的吸收方差值，可以看出在4500～5500cm-1、6900～7500cm-1波段的方差值较大。综合以上分析，本研究选用4500～7500cm-1区间作为建模波段。

图2 每个波长点吸收值与对照值相关系数图

图3 近红外光谱方差图谱

3.5 光谱预处理方法的选择

在近红外光谱扫描过程中，环境温度、湿度的变化，填充不均匀等因素可能引起光谱基线的飘移、噪声和光散射等干扰，对光谱进行适当的预处理可以减少干扰，充分提取光谱中的有效信息，提高校正模型的预测精度。本研究比较了各种光谱预处理方法对黄芩苷和汉黄芩苷校正模型的R（交叉验证）和RMSECV的影响，结果见表3。可见，对于黄芩苷模型，采用SNV，一阶导数，Savitzky-Golay卷积平滑法的建模效果较好，而对于汉黄芩苷，采用原始光谱的建模效果较好。

3.6 校正模型的建立及预测结果

图4 HPLC测定值与NIR光谱预测值的相关图

选择合适的建模波段，并对光谱进行适当的预处理，采用留一法交叉验证确定建模最佳主成分数，采用偏最小二乘回归（PLS）建立黄芩药材粉末近红外光谱与黄芩苷、汉黄芩苷HPLC含量测定值之间的多元校正模型，见图4。黄芩苷和汉黄芩苷校正模型的相关系数分别为0.995、0.969，验证集预测误差均方根RMSEP分别为0.602、0.221，验证集黄芩苷和汉黄芩苷的相对预测误差分别为-1.45%和0.62%，结果准确，模型的预测性能良好。可见，采用所建立的近红外光谱校正模型可以快速准确地对黄芩药材进行分析。

3.7 小结

本研究提出了一种应用近红外光谱技术快速分析黄芩药材的方法，在比较了不同的光谱采集方式，筛选合适的建模波段和适当的光谱预处理方式的基础上，采用偏最小二乘回归法建立了黄芩苷和汉黄芩苷的近红外光谱定量校正模型，模型成功建立后，在短时间内就可以完成光谱采集，并计算出比较准确的含量，提供准确可靠的质量控制数据，尤其适用于中药生产中大批量药材的快速分析。本法快速简便，准确可靠，可进一步推广用于其他中药材的质量控制。

[1]符洪,肖新月,张南平,等.药用黄芩中主要化学成分分析[J].药物分析杂志, 2003,23(1): 33-39.

[2]宋双红,王哲制,张媛,等.黄芩药材HPLC指纹图谱的研究[J].中国药学杂志,2006,6(41): 413-417.

[3]李云鹏,黄芸,魏春娥,等.紫外分光光度法测定黄芩中总黄酮含量[J].河北中医药学报,2007,22(11): 36-39.

[4]He Y,Li XL,Deng XF.Discrimination of varieties of tea using near infrared spectroscopy by principal component analysis and BP model[J].J Food Engineering,2007,79(4): 1238-1342.

[5]瞿海斌,李斌,刘雪松,等.红参醇提取液浓缩过程近红外光谱在线分析方法[J].中国药学杂志,2005,24(40): 1897-1903.

[6]孙君明,韩粉霞,闰淑荣,等.傅里叶近红外反射光谱法快速测定大豆脂肪酸含量[J].光谱学与光谱分析,2008,6(28): 1290-1295.

R282.710.5；R917

B

1671-8194（2011）34-0054-03

*通讯作者