纳滤技术浓缩纯化玉米肽及对其醒酒活性的影响

于国才，何 慧*，靳 桢，黄文浩，李江涛

(华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)

纳滤技术浓缩纯化玉米肽及对其醒酒活性的影响

于国才，何 慧*，靳 桢，黄文浩，李江涛

(华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070)

探讨纳滤技术浓缩纯化玉米肽的过程中肽的醒酒活性的变化。本研究选用截留分子质量160D和360D的两种纳滤膜，对pH8.0玉米肽液(Mw＜5kD)进行浓缩纯化，比较两种膜对其中主要成分的传质效果，并进一步探讨透析过滤过程对玉米肽醒酒活性的影响。结果表明，玉米肽液浓缩过程中，相对于360D纳滤膜，160D纳滤膜对肽类、氨基酸和Na+均具有较低的传质效率，但其对玉米肽的截留率却在88.80%以上，脱盐效果与360D膜相当，经3次透析后，脱盐率达94.6%，且160D纳滤膜在透析过程中很好地保持玉米肽对乙醇脱氢酶(ADH)的激活作用。结论：宜选用160D纳滤膜对玉米肽液进行浓缩纯化，透析过滤3次。

纳滤；玉米肽；醒酒；透析；脱盐；乙醇脱氢酶

纳滤是一种新型的膜分离技术，其在有机化合物的分离中具有很强的优势，特别适合于分离热敏性物质如果汁、蛋白质、多肽、氨基酸等，且对单价离子截留率很低[1]，因此被广泛应用于食品工业，尤其是饮料行业加工过程中料液的分级分离、浓缩和脱盐等[2]。蛋白质水解液成分相当复杂，其中很多肽类或氨基酸分子质量相近、性质相似，有的仅是净电荷数的不同。相对于超滤膜单纯基于筛分原理进行的分离而言，纳滤膜技术对肽类和氨基酸的分级分离具有明显的优势。纳滤膜通过空间位阻和电荷效应的共同作用可对溶液中的肽类和氨基酸进行分离[3]，对分子质量200～1000D的化合物分离效果最好[4]。

上世纪90年代末，Yamaguchi[5]对玉米肽的醒酒作用进行研究，其后相关工作很少见文献报道。本实验室曾对玉米醒酒肽进行一系列的研究[6-7]，并利用超滤技术对其进行分级分离，确定分子质量(Mw)＜5kD的玉米肽级份为醒酒活性最高的级份[8]。本实验在此基础上进一步研究纳滤技术对玉米醒酒肽浓缩脱盐及其对活性的影响，为今后开发专一性的功能性玉米肽产品提供依据，相关研究目前尚未见文献报道。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

玉米黄粉(corn gluten meal，CGM)(粗蛋白含量为58.84%) 正大集团武汉分公司。

Alcalase碱性内切蛋白酶 (19.2 IU/g) 丹麦Novozymes公司；乙醇脱氢酶(alchol dehydrogenase，ADH)(451U/mg) 美国Sigma公司；氧化型辅酶Ⅰ(NAD+) 加拿大Bio Basic Inc公司。

Prepscale切向流1.6L系统超滤设备及截留分子质量5kD的再生纤维素卷式超滤膜(有效膜面积为0.09m2) 美国Minipore公司；实验室小型纳滤膜设备LNG-NF-10、截留分子质量为360D和160D的聚醚砜卷式膜(有效膜面积均为0.25m2) 上海朗极化工科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玉米醒酒肽溶液的制备

按文献[7]方法从玉米黄粉中提取浓缩玉米蛋白→取浓缩蛋白粉适量→按1:25(g/mL)比例加水→沸水浴30min→冷却→调pH值至8.0、温度55℃→加入蛋白粉质量的0.8%Alcalase碱性蛋白酶酶解5h(用1mol/L NaOH稳定pH8.0) →沸水浴10min灭酶活→酶解液过5kD超滤膜→得到膜透过液。

1.2.2 玉米醒酒肽溶液纳滤纯化中各指标的测定

上述5kD超滤膜透过液400mL定容至2L，在一定温度，低压条件下，分别测定玉米肽溶液过360D和160D纳滤膜浓缩过程中，膜通量(flux，F)和膜对肽的截留率(rejection rate，RR)、氨基酸的传质率(transmission rate，TR)。肽浓度的测定采用微量双缩脲法[9]，氨基酸质量浓度的测定采用茚三酮法[10]，Na+浓度的测定采用火焰光度法。

传质率(TR)= Cp/Cr

截留率(RR)= 1－ TR= 1－Cp/Cr

体积浓缩倍数(VCF)=Vo/Vr

Na+含量= WNa+/W肽= CNa+/C肽

脱盐率= 1－(Cr×Vr)/(Co×Vo)

膜通量(F)=Vp/(T×A)

式中：Co、Cp和Cr分别为原液、透过液和截留液中溶质质量浓度(mg/L)；W为溶质质量/mg；Vo、Vp和Vr分别为原液、透过液和截留液体积/L；F为膜通量/(L/m2·h)；T为操作时间/h；A为膜有效面积/m2。1.2.3 玉米醒酒肽的纳滤透析纯化

采用透析过滤法对玉米肽液进行进一步纯化，方法如下：将1.2.2节中制备的玉米肽液过纳滤膜将其浓缩，使其体积浓缩倍数(volumetric concentration factor，VCF)为4，为第一次透析；再加入适量的去离子水使其与透析前的稀释倍数相同，再进行第2次透析，至体积浓缩倍数为4为第2次透析；如此重复透析5次，每次透析固定纳滤压力2bar，料液温度(20±1)℃。取原始液及每次透析结束时的循环液各50mL，冷冻干燥，测定玉米肽冻干粉的各种活性指标及Na+浓度。

1.2.4 玉米肽对羟自由基(·OH)抑制率测定

采用脱氧核糖-铁体系法，测定各级份玉米肽对·OH的抑制率[11]。

1.2.5 玉米肽对乙醇脱氢酶体外激活率的测定

ADH活性的测定依据文献[12]描述的方法进行。1.5mL 32mmol/L pH8.8的磷酸盐缓冲液，1.0mL 27 mmol/L NAD+溶液，0.5mL 体积分数11.5% 乙醇溶液和 0.1mL 0.1mg/mL 玉米肽(corn peptides，CP)溶液混匀，25℃温育5min后，加入0.1mL ADH(0.64μg/mL)。空白组以0.1mL H2O代替0.1mL CP，其他操作相同。摇匀后立即于340nm波长下测定其吸光度，每隔10s读数一次，连续测定5min，取最初线性部分计算还原型辅酶Ⅰ(NADH)的生成量。

ADH活力/(U/mL)=ΔA×V×DF/(6.22×0.1)

ADH激活率/%= [(Up－Uc)/Uc]×100

式中：ΔA为每分钟吸光度增加的值；V为反应总体积(mL)；DF为稀释倍数；0.1为酶溶液的体积/mL；Up和Uc分别为玉米肽组和空白组的ADH活力；6.22为NADH在340nm的毫摩尔消光系数。

1.2.6 统计分析

采用SAS V8统计软件，所有的数据都以x±s表示，组间t检验对试验结果进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 膜通量在玉米肽液纳滤浓缩过程中的变化

图1 膜通量在玉米肽液纳滤浓缩过程中的变化Fig.1 Change in membrane flux during filtration of corn protein hydrolysate through different NFMs

如图1 所示，随着VCF的不断增大，循环液的浓度不断增加，膜污染的程度也不断加大，造成了两种纳滤膜的膜通量均逐渐下降。在VCF为1～3之间变化时，360D纳滤膜因为具有较大的膜孔径，膜通量要高于160D纳滤膜的膜通量。后期当VCF继续增大时，循环液体积小于纳滤设备的最小循环体积(约360mL)时，会有空气进入，导致两者膜通量均较快地下降，并逐渐趋于一致。

2.2 浓缩过程中纳滤膜对玉米肽的截留率(RR)

如图2所示，相同条件下，160D纳滤膜在玉米肽液浓缩过程中对肽的截留率始终高于360D的纳滤膜。160D纳滤膜，开始时对多肽的截留率为100%，随后缓慢下降，最后稳定于88.8%左右；360D纳滤膜，由于孔径较大，小分子质量的多肽易透过膜，因此开始时，对肽的截留率只有53.9%，随着小分子肽逐渐透过膜后，截留率逐渐上升，最后RR亦趋于稳定，稍低于160D纳滤膜。

图2 两种纳滤膜对玉米肽的截留率(RR)随VCF的变化Fig.2 Plot of rejection rate of CPs against volume concentration factor

2.3 浓缩过程中纳滤膜对游离氨基酸的传质效果

如图3所示，相同条件下，360D纳滤膜在玉米肽液浓缩过程中对氨基酸的传质率高于160D的纳滤膜。在玉米肽液浓缩过程中，两种膜对氨基酸的传质率(TR)基本趋势均为缓慢下降。纳滤过程中，浓缩效应和透析效应同时存在，传质率上升表明透析效应占主导(如VCF在2～3.6之间)，传质率下降表明浓缩效应占主导(如VCF在3.6～5.5之间)。

2.4 纳滤膜对Na+的传质效果

如图4所示，相同条件下，360D纳滤膜在玉米肽液浓缩过程中，对Na+的传质率始终高于160D的纳滤膜。如图5所示，浓缩过程中玉米肽中Na+的含量不断下降。多次透析使Na+含量降得更低，且均随透析次数的增加而逐渐下降，透析3次之后两种膜截留产物中的Na+含量相近，脱盐率在95%左右(图6)。

图4 浓缩过程中两种纳滤膜对Na+的传质率Fig.4 Plot of transmission rate of Na+ against volume concentration factor

图5 玉米肽中Na+含量在浓缩过程中的变化Fig.5 Plot of Na+ content in CPs against volume concentration factor

图6 玉米肽中脱盐率在透析过程的变化Fig.6 Effect of volume concentration factor on desalinization rate

图3 两种纳滤膜对游离氨基酸的传质率随VCF的变化Fig.3 Plot of transmission rate of amino acids against volume concentration factor

2.5 纳滤加水透析过滤对玉米肽活性的影响

2.5.1 玉米肽清除羟自由基能力

乙醇在体内代谢会产生·OH，是引起肝细胞损伤的重要诱因之一[13]。本实验室前期研究发现，玉米肽醒酒能力与清除·OH能力之间存在一定关系[6-8]。随着透析次数的增加，肽的纯度不断提高，玉米肽对·OH的半数抑制浓度(IC50)不断降低(图7)。对于360D纳滤膜，相同的透析次数，得到玉米肽对·OH抑制率的IC50比用160D纳滤膜透析得到的产物更低。

图7 玉米肽对·OH抑制率(IC50)随透析过滤次数的变化Fig.7 Effect of number of repeated dialysis on hydroxyl free radical scavenging ability of CPs

2.5.2 玉米肽对乙醇脱氢酶(ADH)的激活作用

本实验室前期研究发现，玉米肽能够直接激活小鼠体内ADH活性[14]，从而加速乙醇在体内的代谢，并且可以用玉米肽对ADH的体外激活率作为衡量醒酒活性的主要指标[7-8]。经过透析过滤后，360D纳滤膜透析过滤产物对ADH的激活率有一定程度的下降，其中透析5次时激活率与原液比显著下降(P＜0.05)，而160D纳滤膜透析产物对ADH的激活率基本没有变化(图8)。提示透过纳滤膜的小分子质量的玉米肽(＜360D)，如二肽、三肽等，对玉米肽激活ADH的贡献较大。

图8 玉米肽对ADH激活率随透析过滤次数的变化Fig.8 Effect of number of repeated dialysis on of ADH activating activity of CPs

3 讨 论

3.1 两种纳滤膜浓缩纯化玉米肽液的比较

利用纳滤膜技术分离和纯化肽类和氨基酸所依据的理论基础主要是Donnan 效应和空间位阻效应。膜表面通常带有一定的电荷，离子与静电膜的电荷相互作用称为Donnan效应。膜的分离选择性由这两种效应共同决定，其中Donnan效应又受溶液的pH值、离子强度、离子组成、多肽、氨基酸浓度以及膜表面电荷密度、电性等因素影响[3]。Pontalier[15]等研究截留分子质量为100D和400D两种聚砜膜的分离机理，认为纳滤膜的选择截留性是几种不同的物化机理共同作用的结果。对于100D的纳滤膜，质量传递以扩散为主；而对400D纳滤膜，则存在两种分离机理：即大分子靠表面静电和位阻的相互作用被截留，而体积小的弱荷电离子则可以进入膜孔中靠表面力(静电力和摩擦力)的作用得以分离。Garem等[4]考察两种无机纳滤膜对β-胰蛋白酶酪蛋白水解液所包含的十种多肽的纳滤性能，结果表明离子强度和pH值将对分离起关键作用。在pH8.0时，由于分子质量较大且负电荷的多肽分子在膜表面沉积，形成凝胶层，增强了膜表面的负电性，使在此pH值条件下带正电的碱性多肽的传质率甚至达100%，其次为中性多肽，酸性多肽透过率最低。类似的pH12的氨基酸混合溶液，中性和碱性氨基酸传质率较高，酸性氨基酸的传质率则大大降低[16]。据此推测，在pH8.0条件下，分子质量较大且带负电荷的玉米肽会在膜表面逐步沉积，形成凝胶层，使膜表面带上负电荷，而且随着浓缩过程的不断进行，表现为膜通量的不断下降(图1)。对于160D的纳滤膜，空间位阻效应起到主要作用，只有极少数的二肽及大部分的游离氨基酸可以透过膜，表现为对肽类高的截留率(88.80%)(图2)，对氨基酸透过率不及360D膜，且随VCF的变大，传质率降到只有10.24%(图3)；而对于360D的纳滤膜，Donnan 效应发挥主导作用，带有正电荷的小分子碱性的肽类及碱性氨基酸会首先透过纳滤膜，表现为初期较低的肽截留率及较高的氨基酸透过率(图2、3)。随着透析的进行，Mw＞360D的多肽由于空间位阻效应被完全截留，Mw＜360D带正电荷的多肽及氨基酸逐渐透过膜，而Mw＜360D带有负电荷的化合物则由于电负性膜的排斥作用，很难透过纳滤膜。表现为后期较稳定的且较高的肽截留率(85.20%以上)(图 2)。

在制备浓缩玉米蛋白时的盐析步骤以及蛋白酶解过程需加入NaOH稳定pH值，均会引入Na+，过高的盐浓度对于玉米肽作为一种功能食品来讲是不利的。纳滤膜对单价盐具有较低的截留率，适用于对溶液脱盐[2]。纳滤膜对Na+的传质主要是利用空间位阻效应，Na+的直径要比160D纳滤膜孔径小，易透过膜，但是360D膜的孔径更大，因此其Na+传质率要高于160D纳滤膜(图4)。经过3次透析后，这种差别逐渐被掩盖，脱盐率在94%左右，透析5次脱盐率上升为96%左右，并且由于混合肽液中存在－COO－，会与Na+以较强的静电引力结合，故此条件下Na+并不可能被完全脱除(图6)。3.2 纳滤膜多次透析过滤玉米肽对其醒酒活性的影响

本实验室前期研究结果显示：玉米肽之所以能够促进酒精代谢和缓解由此引起的肝脏内的氧化应激，主要是因为小分子质量的疏水性多肽对ADH的激活作

用，而玉米肽的抗氧化作用同样对缓解氧化应激起到协同作用[14]。本研究中发现经过纳滤纯化后，玉米肽清除·OH的能力增强了(图7)，并且随着透析次数的增加而提高。但是，玉米肽对ADH的激活率却下降了(图8)。同时也注意到，与160D纳滤后的玉米肽相比，360D纳滤膜透析后的产物清除·OH的能力较未纯化前提高更多，而对ADH的激活率却降低得更多。这提示一些无法透过160D纳滤膜，却可以透过360D纳滤膜的二肽、三肽等小分子量的玉米肽可能在激活ADH的方面起着很重要的作用，这与本室前期得出的“小分子质量的疏水性多肽对ADH起主要激活作用“的结论是一致的。而分子质量较大的玉米肽对于清除·OH的贡献更大。此实验结果进一步佐证了笔者以前的结论[14]：即玉米肽的醒酒作用主要是通过低分子质量的疏水性小肽对ADH的激活作用，而分子量较大的多肽清除·OH能力对醒酒活性的贡献是起协同作用的。

4 结 论

4.1 在Mw＜5kD玉米肽液浓缩过程中，360D纳滤膜对玉米多肽、氨基酸及Na+均具有较高的传质率。当溶液pH值偏离等电点时，纳滤膜对带电荷的氨基酸或多肽的截留率发生明显变化，Donnan效应发挥主导作用。

4.2 160D纳滤膜对玉米肽的截留率在88.80%以上，脱盐效果与360D相当，多次透析纯化仍较好地保持了玉米肽对ADH的激活作用。综合考虑玉米肽活性保持、脱盐及能耗，宜选用160D纳滤膜对玉米肽液进行浓缩，透析过滤次数以3次为宜，脱盐率达94.6%。

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Nanofiltration for Concentration and Purification of Corn Peptides and Their Effects on Antialcoholism Activity

YU Guo-cai，HE Hui*，JIN Zhen，HUANG Wen-hao，LI Jiang-tao
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Nanofiltration membranes (NFM) with molecular weight cut off (MWCO) 160 D and 360 D were used to concentrate and purify corn protein hydrolysate of MW < 5 kD at pH 8.0. The mass transfer efficiencies of peptides, amino acids and sodium ion (Na+) in concentration process and the changes in hydroxyl free radical scavenging activity and antialcoholism activity of corn peptides (CPs) in dialysis process were evaluated. The results showed that although 160 NFM exhibited lower transmission/rejection rates of CPs, amino acids and Na+as compared to 360 D NFM, the rejection rate of CPs by 160 D NFM was above 88.80% and it provided desalting effect similar to that of 360 D NFM and yielded a desalting efficiency of 94.6% after triple repeated dialysis. Moreover, the activating effect of corn peptides on alcohol dehydrogenase (ADH) was kept very well in 160 D NFM dialysis. In general, 160 D NFM is suitable to be used for the concentration and purification of corn protein hydrolysate and the number of repeated dialysis should be no more than 3.

nanofiltration (NF)；corn peptides；antialcoholism；dialysis；desalination；alcohol dehydrogenase (ADH)

TS210.9

A

1002-6630(2011)08-0010-05

2010-08-05

国家自然科学基金项目(30972043)；国家“863”计划项目(2008AA10Z314)

于国才(1983—)，男，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail：87283704@163.com

*通信作者：何慧(1960—)，女，教授，硕士，研究方向为食品化学。E-mail：hehui@mail.hzau.edu.cn