奶牛衣原体和布氏杆菌混合感染的诊断

李翠蓉 （西昌学院 四川 西昌 615013）

牛衣原体病是由鹦鹉热衣原体引起的呈地方流行性经过的人兽共患病，以母牛流产、犊牛肺肠炎、多关节炎、结膜炎、脑炎和公牛精囊炎等为其主要特征，常使养牛业蒙受巨大的经济损失，并对人类健康构成威胁。

许多研究者发现，牛罹患衣原体病时，由于并发或继发感染，常使病情复杂化，给病的诊断和防治造成很大困难。Mage(1976)在法国检查1215份流产母牛胎盘时，在244份中发现了衣原体，在429份中发现了布氏杆菌。Jahnson(1983)在英国进行布氏杆菌病普查时，发现许多流产母牛血清中合有衣原体抗体。牛衣原体性流产还可能与布氏杆菌病、沙门氏菌病、弯杆菌病、链球菌病和毛滴虫病等混合感染。在对西昌市某奶牛衣原体性流产调查时，发现某些牛群存在着衣原体病与布氏杆菌病的混合感染。

1 材料

1.1 病史

西昌市某规模化奶牛场有荷斯坦牛78头、西门塔尔牛125头(共203头)，2010年2月起，不同牛舍的4个牛群中，相继暴发犊牛肺炎、传染性结膜炎、多关节炎和妊娠母牛的流产，疫情由点到面，逐渐波及全群，到12月底，共计流产38头，早产6头，死产和干尸化胎3头，发生病率23.15%。流产多在妊娠7～9月龄，病牛无先兆，流产前后体温、精神、食欲均正常，有的出现轻度乳房炎症，60.86%罹病母牛胎衣不下，胎膜出血、水肿，子叶肿大如馒头，难以剥离，其上有大小不等淡黄色干酪样坏死灶，受胎率显著下降。

1.2 病料

采集流产胎犊肝脾1份，羊水和流产母牛阴道分泌物12份，初乳6份，流产10d内乳汁6份，母牛血清89份，3～5月龄犊牛血清8份，供病原分离和血清学检查用。

2 方法

2.1 血清学检查

从不同牛舍的7群牛采集血清97份，60℃30min灭能后作衣原体(CFT)和布氏杆菌(试管凝集反应)检查。

2.2 布氏杆菌分离

以无菌技术将病料接种在血液琼脂、血清胰蛋胨琼脂，含1/200000龙胆紫血清胰蛋白琼脂、马丁肉汤、厌气肝汤，置10%CO2环境培养7～15d，当有疑菌落出现时，除进行形态、培养和生化特性鉴定外，还将其新鲜培养物以0.5%石炭酸生盐水制成抗原，与布病诊断液进行试管凝集试验鉴定。同时作其它病原菌常规培养。

2.3 衣原体分离

2.3.1 鸡胚接种 将病料以含抗生素的pH7.6PBS(链霉素2000IU/ml、卡那霉素1000IU/ml∶)制成1∶10悬液，4℃静置4～6h，2000r/min离心30min，取中层清液5～10ml，以同样PBS等量混合，再次离心，如此重复处理3次，用第3次离心的上清液接种6～7日龄鸡胚，0.2ml/胚，每份病料接种5枚胚，37℃孵育，收取4～7d死亡鸡胚的卵黄囊膜。

2.3.2 染色镜检 取死亡鸡胚的卵黄囊膜，印痕触片，以马契维诺(Macchiavello)法染色镜检。步骤为，触片自然干燥后，以甲醇固定，水洗，滴加碱性复红溶液染色5min，水洗，在柠檬酸溶液中脱色3s，至呈粉红色为宜，水洗，再以美蓝复染15s，水洗，吸干，镜检。

2.3.3 包涵体与碘染试验 分离菌株的包涵体检测按《Bergy鉴定细菌学手册》第8版要求进行，病料接种小鼠，取腹水涂片，H·E染色检查。同时，用在鸡胚上继代4～5次的感染鸡胚卵黄囊膜的超薄切片，Lugol碘液染色，镜检。

2.3.4 药敏试验与动物试验 分离菌株对磺胺嘧啶钠敏感性试验，采用杨宜生等著《衣原体和动物衣原体病》介绍的方法。用感染鸡胚卵黄囊膜悬液(滴度为10-7LD50/0.2ml)接种：①妊娠豚鼠4只(腹腔，1.0ml/只)；②幼龄豚鼠4只(皮下，0.5ml/只)；③孕母羊1头(颈静脉，10ml)。每种动物均设有正常鸡胚卵黄膜悬液对照。

2.3.5 分离菌株血清学鉴定 对分离菌株作补体结合试验(CFT)血清学鉴定。

3 结果

3.1 牛群血清

对5群生产母牛77份血清，初产母牛群12份血清和犊牛群8份血清的检查结果，衣原体病阳性率为22.68%，布病阳性率为47.43%，两病均阳性者13.40%(见表1)。

表1 奶牛群血清学检查结果 （Ig）

3.2 布氏杆菌鉴定

从25份病料中分离出5株布氏杆菌(胎犊1株，羊水1株，阴道分泌物2株，初乳1株)，与布病阳性血清进行试管凝集反应时，除初乳菌株可疑外，其余均呈强阳性反应。初代分离时需要10%C02。分离菌株能分解尿素(8～10h)，产生H2S，1/100000碱性复红和1/200000龙胆紫不能抑制其生长，可被1/50000硫堇抑制。从而证实分离菌株确系牛布氏杆菌。

部分病料还分离出了葡萄球菌，双球菌、链球菌、大肠杆菌；李氏杆菌、沙门氏菌、弯杆菌和霉形体等分离培养为阴性。

3.3 衣原体鉴定

3.3.1 分离株CY1、CY2、CY3毒力测定与染色鉴定 分别从胎犊、羊水和阴道分泌物中分离出3株衣原体(CY1，CY2，CY3)，在7日龄鸡胚上继代4～5次后，毒价可达到10-7LD50/0.2ml～10-8LD50/0.2ml。卵黄膜触片，经Macchiavello法染色，15×100倍镜下观察，可看到在蓝色背景上有多量的圆形红色颗粒状的衣原体。

3.3.2 包涵体与碘染试验 感染小白鼠腹腔液涂片，染色，镜检结果：（1）在上皮细胞和白细胞胞浆中，有零星散在的衣原体，胞浆充满空泡；（2）衣原体在胞浆中聚积成团，但仍较稀疏，大小不一，多少不定，细胞结构轻度破坏；（3）包涵体致密，位于细胞核旁，呈现帽状、馒头状、新月状等形态，有的细胞有两个包涵体；（4）细胞和包涵体破裂，衣原体散出。感染鸡胚卵黄囊膜的超薄切片，碘染包涵体不着色。

3.3.3 动物试验与药敏试验 分离菌株CY1、CY2、CY3可以引起妊娠豚鼠流产、死产，幼龄豚鼠的肺炎，腹膜炎、结膜炎，孕母羊的高热综合征，并从流产豚鼠胎儿、肺炎豚鼠的肺门淋巴结和胎羔体内重分离出衣原体。经用7日龄鸡胚测定结果，有磺胺嘧啶钠组滴度CY1为10-7LD50/0.25ml，CY3为10-7LD50/0.25ml，空白对照(无磺胺嘧啶钠)为10-7LD50/0.25ml和10-7LD50/0.25ml，结果一致，说明CY1和CY3对磺胺嘧啶钠不敏感。

3.3.4 分离菌株血清学鉴定 CFT表明，分离菌株CY1、CY2、CY3衣原体制备的抗原和抗血清，均能和鹦鹉热衣原体B11001株(中国农科院兰州兽医研究所提供)，发生交叉血清学反应，而不与正常鸡胚卵黄囊膜制备的抗原和抗皿清发生反应。

4 讨论

（1）从西昌市某罹病奶牛群中，同时分离出了鹦鹉热衣原体和布氏杆菌，这与牛群的发病情况和血清学检查结果相吻合。由于衣原体和布氏杆菌均可导致母牛繁殖障碍综合征，在临床上又一时难以鉴别，更增加了诊断和防治上的困难。（2）衣原体病和布氏杆菌病均为严重威胁人畜健康的人兽共患病，而且，这两种疫病在奶牛群中同时传播，又有其不可忽视的流行病学意义。研究表明，牛衣原体性流产时，能通过初乳和乳汁大量排出衣原体，此研究也证实了这一点。两种病原的混合感染，在母牛发病后某一阶段能通过乳汁排出大量病原菌，构成对犊牛和人群的直接威胁，因此，应加强对奶牛衣原体病和布氏杆菌病防治方法研究，并注重在疫场中同时清除这两种病的综防措施，已是当务之急。（3）是西昌市首次暴发奶牛衣原体和布氏杆菌混合感染，并分离出了病原体，同时，对从北方引进的一批罹病黄牛群进行血清学检查时，发现26.66%(8头/30头)的血清中含有诊断意义的衣原体抗体。另一群引进的西门塔尔牛的阳性率也达到10.53%(4头/38头)，从而可以初步断言，我国牛群的衣原体感染可能较为广泛，应引起重视，纳入计划，开展调查，对我国养牛业具有重大而深远的意义。