禽白血病J亚型的诊断试验

刘 玲 王林川 邓月嫦 姚晓辉 李建宏 叶健聪 黄鹏华

禽白血病病毒(ALV) 是一种反转录病毒，呈圆形或椭圆形，有囊膜，直径约80～120 nm。根据囊膜蛋白的抗原性不同，ALV现有A、B、C、D、E、F、G、H、I、J等亚群，仅A～E和J亚群从鸡分离到，其余亚群见于其他鸟类。A、B、C、D、J可引起经典的以淋巴样细胞瘤为主的白血病，也有少数表现其他细胞类型的肿瘤，如纤维素性肉瘤，红细胞增生病、骨瘤等。A、B和J亚群为发生于田间的外源性病毒，而C、D亚群很少发生于田间，E亚群病毒为极普遍存在的内源性白血病病毒。ALV可垂直传播又可水平传播。ALV-J亚群是所有外源病毒中传播最迅速及致病能力最强的。它也可以水平传播发生于任何年龄的鸡群中，研究证明ALV- J病毒在肉鸡早期(4～6周龄)传播效率较高。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 来自广东某低免蛋鸡场。无菌采集病鸡的血并分离血清；肝、脾、卵巢等。

1.1.2 试剂 ELSA试剂盒子均购自美国IDEXX公司，ALV-J及ALV-AB的批次分别为09268-CF650及09257-ME477。血液及病毒的DNA/RNA提取试剂盒购自BIOMEGA公司。Ex-Taq酶购于大连宝生物工程公司。

1.1.3 仪器设备 酶标仪、洗板机、PCR仪等。

1.2 方法

1.2.1 临床及剖检观察病理变化 送检病鸡为26周龄，临床主要表现生长迟缓、产蛋下降。病鸡采血备用，按常规方法进行剖检观察、采集病料。

1.2.2 血清学检测 据临床及病理变化，送检病鸡，采血后用ELISA方法检禽白血病A、B亚型(ALV-A、B)；禽白血病J亚型(ALV-J)，按试剂盒说明书严格操作。

1.2.3 分子生物学 根据已发表的文献[2,3]，设计PCR引物如表1所示，并由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR引物设计选取的基因片段及目标片段大小见表2。取送检病鸡取内脏器官(肝、脾、卵巢等)，提取DNA进行PCR扩增，凝胶电泳观察结果。

表1 PCR引物

表2 PCR目的片段

2 结果

2.1 剖检病理变化

剖检可见∶肝，脾肿大、出血、坏死有弥漫性分部的白色细小的肿瘤结节；卵巢肿大、有明显大块肿瘤结节；胸腔骨膜处有大块的肿瘤结节肿瘤。

2.2 血清学结果

据临床及病理变化，送检病鸡，采血后用ELISA方法检ALV-A、B及ALV-J，其中ALV-J的检出率最高可达33.7%(31/92)；ALV-A、B最高为7.5%(6/80).

2.3 PCR结果

将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果显示：ALV-J可以扩增出约545bp的目的片段，即ALV-J阳性，见图1。

图1 ALV-J扩增结果M：DL2000marker；1.ALV-J；2.ALV-A；3.ALV-B&D；4.ALV-C；5.阴性对照

3 讨论

此试验通过病鸡临床表现并结合血清学及分子生物学，确诊了海兰褐壳商品蛋鸡的ALV-J的感染。发病鸡群ALV-J的感染率最高可达33.7%。此病例的成功确诊，为该蛋鸡场生产管理决策提供了重要的依据，同时也为今后开展该病的研究奠定了基础。

ALV在动物体内有4种存在形式，检测到抗原阳性时抗体检测为阴性；检测到抗体阳性时抗原检测为阴性；抗原抗体都同时为阳性；抗原抗体都检不到，但不说明不存在感染[1]。比如血清学检ALV-AB最高的感染比例为7.5%，但PCR抽检为阴性。

禽白血病是由禽白血病病毒引起的慢性传染病，包括各种良性和恶性肿瘤，白血病病毒是一种反转录病毒(类似于人的艾滋病毒，但不感染人)。临床剖检时注注意与其它肿瘤病区分。如鸡马立克氏病等。禽白血病病毒分为A、B、C、D、E和J等亚群，其中A、B、C、D和J亚型属于外源性禽白血病病毒，不会通过染色体传递，但致病性强。E亚型为内源性白血病病毒，整合于染色体中，通常致病性很弱或无致病性。而A、B、C、D亚群以淋巴细胞瘤为主，还有多种其他类型细胞瘤，包括血管瘤；J亚群以骨髓细胞瘤为主，也有较高比例的血管瘤[4]。

目前国内外对此病仍无有效的疫苗防控。对于自己育种的企业，尽量小群饲养，定期检测，发现有阳性病鸡，全群淘汰，以达净化目的。本文样品来源的发病蛋鸡场主要是从外部引种，故建议从引种的源头控制。即从无ALV感染的种子中心引种。再者通过生产管理严格把关。如人员进出、环境、药物疫苗等环节从严控制。结合本案例为预防本病在此特别提到两个关键点，一是是孵化出雏时的管理，因垂直感染的雏鸡出壳后就可排毒，在孵化厂雏鸡运输箱内高度密集，同一箱内只要有1只雏鸡感染，即可在运输期间使同箱内20%～30%的鸡接触感染[4,5]。送检样本的发病鸡群与同一孵化地点同一批次出雏的小鸡相比，饲养于其它场地的鸡群，生产成绩正常。因此可排除该场发病鸡群在孵化出雏的过程中被感染；二是鸡群所用的弱毒疫苗的来源控制.因禽白血病等垂直传播疾病污染活疫苗的事件在国内也曾报道[4]。但是送检样品的蛋鸡场为低免场，没使用活疫苗免疫，故活疫苗污染传播的原因可以排除。

ALV感染蛋鸡群所造成的经济损失重大。此发病鸡群ALV-J约34%的感染比例，按每只鸡饲养到26周龄的成本计算(鸡苗成本、饲料成本、人力资源成本、水电成本)，每1000只蛋鸡损失约6000元。