蓝莓叶中抗氧化物质提取工艺研究

徐丽珊，黄启亮，汪雪君

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004)

蓝莓叶中抗氧化物质提取工艺研究

徐丽珊，黄启亮，汪雪君

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004)

主要以对DPPH自由基的清除能力为抗氧化指标，研究蓝莓叶中抗氧化物质的提取工艺。探究了pH、提取温度、料液比、提取时间等因素对蓝莓叶中抗氧化物质提取的影响。在单因素和正交实验中，确定了各因素影响蓝莓叶中抗氧化物质提取的主次顺序为:料液比＞提取温度＞酸碱度＞提取时间，并得到了最佳提取工艺条件:料液比为1∶14(g∶mL)，提取温度为100℃，酸碱度为pH2.0，提取时间为60min。最佳工艺条件下，蓝莓叶提取物中抗氧化活性为159.88mg/g·FW。

蓝莓叶，抗氧化活性，DPPH，提取工艺，正交实验

近些年，从植物中寻找安全、高效的天然抗氧化剂成为食品研究的热点。蓝莓是杜鹃花科越橘属植物，原产、主产于美国，其果实中含有丰富的抗氧化物质［1］，是一种被联合国粮农组织(FAO)公认的营养保健果品。我国蓝莓栽培虽然起步晚，但发展势头迅猛，浙江省栽培面积就已近万亩，而且还在不断迅速扩张，随之而来，就会产生大量的蓝莓叶。相关研究表明，蓝莓叶中也含有丰富的抗氧化物质［2］，如黄酮类物质等［3］，具有很高的药用价值［3－5］。如从蓝莓叶中提取抗氧化物质，就可更好地实现蓝莓叶的存在价值。本实验旨在探讨提取蓝莓叶中的抗氧化物质的提取工艺，以寻求新型、高效的天然抗氧化剂的制备方法，提高蓝莓种植的经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜、嫩绿、丰硕的蓝莓叶 取自浙江师范大学蓝莓基地;无水乙醇 分析纯，杭州萧山化学试剂厂;DPPH 上海如吉生物科技有限公司。

Uv1000紫外吸光光度计 上海天美科学仪器有限公司;分析天平、PB－10 pH计 北京赛利多新斯仪器系统有限公司;Sc－5A超级恒温箱 宁波海曙亿恒仪器有限公司;GZX－9140MBE数显不锈钢鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;日立CR22G高速冷冻离心机。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝莓叶提取液的制备 称取一定量洗净沥干并剪碎的蓝莓叶，按一定的料液比加入提取剂，恒温浸提一定时间，离心，将提取液定容到一定体积。

1.2.2 DPPH标准曲线的绘制 精确称取DPPH 10.0mg，用无水乙醇定容至 100mL，配成浓度为0.1mg/mL 的溶液。吸取 0.00、1.00、1.00、0.50、0.50、0.50、0.25mL 溶液，分别加入无水乙醇 2.00、4.00、3.00、4.50、7.00、6.00mL，从而得到浓度为 0.00、4.00、6.70、10.00、14.30、20.00、33.30μg/mL 的 DPPH 标准液。以无水乙醇做空白对照，在517nm处测标准液的OD值。以标准液浓度和OD值回归处理后，制作标准曲线。

1.2.3 DPPH法测定抗氧化物质的含量

1.2.3.1 自由基的清除率计算 取稀释的提取液2mL，加入2mL配制的DPPH溶液，混匀静置60min，517nm处测其吸光度(Ai)，以溶剂为参比，于517nm处测定吸光度(Ac);同时，取稀释的提取液2mL，加入2mL无水乙醇，充分混匀，测定空白对照的517nm处的吸光度(Aj)。

式中:Ac:2mL溶剂加2mL DPPH溶液的吸光度(仅含DPPH乙醇溶液);Ai:加2mL待测液加2mL DPPH溶液的吸光度;Aj:2mL待测液加2mL溶剂的吸光度空白对照的吸光度值(样品与无水乙醇用以消除样品本身颜色的影响)。

1.2.3.2 抗氧化物质活性计算:

抗氧化活性(清除DPPH量，mg/g·FW)=清除率×(DPPH浓度×体积)/(样品浓度×样品体积)［7］

1.2.4 单因素实验 本实验对蓝莓叶中抗氧化物质提取进行工艺优化，主要选用提取温度、提取时间、料液比和酸碱度作为考察因素。

1.2.5 正交设计实验 通过单因素实验结果分析，选择提取温度、提取时间、料液比和酸碱度4个因素，设计了4因素3水平正交实验，所采用的正交表为L9(34)，以浸提液中抗氧化物质活性作为实验结果，筛选蓝莓叶中抗氧化物质提取的最佳条件。

1.3 统计学处理

采用Excel 2003进行回归和相关分析。

2 结果与讨论

2.1 DPPH标准曲线及方程

回归方程为 y=23.209x+0.0078，R2=0.9996，其中y为实验所得的吸光值，x为样品浓度(mg/mL)，标准曲线见图 1。结果表明，DPPH浓度在0～0.0333mg/mL范围内具有良好的线性关系。

图1 DPPH标准曲线

2.2 提取溶剂的确定

常用的溶剂有水、甲醇、乙醇、丙酮等。甲醇毒性较大，丙酮的毒性也比较高，丙酮沸点较低，极易挥发，生产过程中损失较大，提取后若去除不完全，会存在安全性问题，不宜用于实际生产;而乙醇广泛应用于活性成分的提取，安全性高。故以乙醇、水为溶剂设计实验。

称取一定量洗净沥干剪碎的蓝莓叶，按照料液比为 1∶10，分别加入 0%、10%、30%、50%、70%、90%的乙醇溶液置于40℃的水浴锅中，浸提60min。测定蓝莓叶提取液的抗氧化活性，结果如图2。

图2 不同浓度乙醇对提取物抗氧化活性的影响

由图2可知，在乙醇浓度为0%～30%之间，随乙醇浓度增大，抗氧化活性增大;当乙醇浓度再增大时，抗氧化活性反而降低。

分别以30%乙醇溶液和自来水为提取溶剂，其余提取条件相同，比较提取物的抗氧化活性，结果如表1。

表1 不同提取溶剂对提取物抗氧化活性的影响

表1表明，自来水(100℃)的抗氧化活性比30%(40℃)的乙醇溶剂高，而且在实际生产中，水比乙醇溶液经济实惠很多，操作也方便，所以采用水作为提取溶剂，作为工艺优化的提取方法。

2.3 水提法提取蓝莓叶中抗氧化物质

2.3.1 单因素实验

2.3.1.1 提取温度的影响 称取一定量剪碎的蓝莓叶，按照料液比 1∶10 加入自来水，分别在 40、60、80、100℃下提取60min，结果如图3。

图3 温度对提取物抗氧化活性的影响

由图3可看出，随着提取温度的升高，抗氧化物质活性呈上升趋势，可见提取温度对抗氧化物质提取有一定的影响。

2.3.1.2 料液比的影响 称取一定量剪碎的蓝莓叶，按照料液比1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 自来水，在80℃下提取60min，结果如图4。

由图4可看出，随料液比的增大，抗氧化活性逐渐增大，表明随料液比的增加，蓝莓叶中抗氧化物质的提取率逐渐增加，当料液比1∶14时，对抗氧化物质提取效果最好，提取液抗氧化活性最高。

图4 料液比对提取物抗氧化活性的影响

2.3.1.3 pH的影响 称取一定量剪碎的蓝莓叶，按料液比1∶10分别加入 pH 为 2、4、6、8 的自来水，在80℃下提取60min，结果如图5。

图5 不同pH对提取物抗氧化活性的影响

由图5可见，当提取液pH=2时，抗氧化活性最高，pH在4～8时蓝莓叶提取液抗氧化活性趋于平衡，且差异并不显著，可知在此pH区间对蓝莓叶抗氧化物质提取影响不大。

2.3.1.4 提取时间的影响 称取一定量剪碎的蓝莓叶，按照料液比1∶10加入自来水，在80℃下分别提取 30、60、90、120、150、180min，结果如图 6。

图6 不同提取时间对提取物抗氧化活性的影响

结果如图6，提取时间为30～60min时，抗氧化活性逐渐提高，提取时间60～180min时，抗氧化活性逐渐降低。在不同的提取时间条件下，抗氧化活性变化趋势并不明显，可见提取时间对蓝莓叶抗氧化物质的提取影响不明显。由图可知，提取时间为60min时抗氧化活性最高，与其他提取时间相比较，差异极显著(P＜0.01)。

2.3.2 正交实验 在单因素实验的基础上，选提取温度、料液比、pH、提取时间为考察因素，以蓝莓叶提取液中抗氧化活性为指标，采用正交表L9(34)进行优化正交实验。利用4因素3水平正交实验分析了上述因素对蓝莓叶中抗氧化物质提取效果的影响，分析蓝莓叶中抗氧化物质的最佳提取工艺。因素水平选取如表2所示，正交实验结果及分析见表3。

由表3可知，对蓝莓叶提取液抗氧化活性影响最显著的是料液比，其次是提取温度、pH、提取时间。在实验设计范围内，最优组合为A3B3C2D1，即料液比为1∶14，提取温度 100℃，pH2，提取时间为 60min。实验9的提取工艺条件满足最佳工艺条件，可取得最高的抗氧化活性159.88mg/g·FW。

表2 正交实验因素水平表

表3 蓝莓叶抗氧化活性正交实验结果

3 结论

通过单因素实验和正交实验，可知影响蓝莓叶抗氧化物质提取率的因素顺序为:料液比＞提取温度＞pH＞提取时间;确定了蓝莓叶抗氧化物质的最佳提取工艺条件为:提取温度 100℃，提取时间60min，pH2，料液比为 1∶14(g∶mL)。在此工艺条件下，蓝莓叶提取物抗氧化活性最高。

本实验通过比较不同提取条件对蓝莓叶抗氧化物质提取的影响，寻找出一种最佳的提取条件，应用于抗氧化产品的研究开发，以新型天然产品取代化学合成品。这不仅合理利用了蓝莓叶，使之“变废为宝”，而且为抗氧化产品的生产提供了新的抗氧化资源，为今后更加进一步开发利用蓝莓叶积累了宝贵的经验，进行了有益的探索。

［1］王玲，李正全，潘太全.蓝莓富含抗氧化物质［J］.中国果业信息，2009(4):28.

［2］张颖畅，孟宪军，李小红.大孔树脂纯化蓝莓叶总黄酮的工艺研究［J］.食品与发酵工业，2008，34(1):133－137.

［3］曹纬国，刘志勤，邵云，等.黄酮类化合物药理作用的研究进展［J］.西北植物学报，2003，23(12):241－247.

［4］Chung H S，Chang L C，Lee S K，et al.Flavonoid constituents of chorizanthe diffusa with potential cancer chemopreventive activity［J］.Agric Food chem，1999，47(1):36－41.

［5］战伟伟，司振军，王超萍，等.蓝莓叶原花青素提取工艺研究［J］.粮食与油脂，2010(6):39－42.

［6］彭长莲，陈少薇，林植芳，等.用清除有机自由基DPPH法评价植物抗氧化能力［J］.生物化学与生物物理进展，2000，27(6):658－661.

［7］陈守江，姜松.果蔬贮藏过程中内源总抗氧化活性的变化［J］.食品科学，2004，25(6):172－175.

Study on the extraction technology of antioxidant activity from blueberry leaves

XU Li－shan，HUANG Qi－liang，WANG Xue－jun

(Zhejiang Normal University College of Chemistry and Life Science，Jinhua 321004，China)

Extraction technology for antioxidant activity from blueberry leaf was optimized，and the clearance of DPPH free radical as an indicator was taken for antioxidant.Different pH，extraction temperature，the ratio of solid to liquid and extraction time were compared on the effect of the antioxygenic activity of extractions.With single factor and orthogonal experiments，the primary and secondary order of effect of the factors water extraction method for the extractions antioxidant activity from blueberry leaves was determined:the ratio of solid to liquid＞extraction temperature＞pH＞extraction time.The optimum process conditions was determined:the ratio of solid to liquid was 1∶14(g∶mL)，temperature was 100℃，pH was 2.0，extraction time was 60min.Under the above conditions，the antioxygenic activity could reach to be 159.88mg/g·FW.

blueberryleaf;antioxygenicactivity;DPPH spectrophotometricmethod;extractionprocess;orthogonal experiment

TS255.1

B

1002－0306(2011)09－0270－03

2010－10－08

徐丽珊(1966－)，女，副教授，硕士，研究方向:生理生化和食品营养。

浙江省科技计划项目(2010C34002)。