马尾松花粉中总黄酮类物质提取条件的研究

李雪梅，陈 辉，李书国，曹雅虹

(河北科技大学，河北石家庄050018)

马尾松花粉中总黄酮类物质提取条件的研究

李雪梅，陈 辉，李书国，曹雅虹

(河北科技大学，河北石家庄050018)

采用溶剂浸提法从马尾松花粉中提取总黄酮类物质。通过单因素实验对影响马尾松花粉黄酮类物质提取率的因素进行了研究，并通过正交实验设计对其提取工艺进行了优化。结果表明，脱脂处理对总黄酮类物质的提取率没有明显影响;乙醇是马尾松花粉总黄酮类物质的最适提取剂，其最佳提取条件为乙醇浓度95%，料液比为1∶25，温度为70℃，在此条件下，总黄酮类物质的提取率为13.52mg/g。

总黄酮类物质，马尾松花粉，提取

松花粉又名松黄，是马尾松、油松或同属树种的雄性生殖细胞。由于松花粉源自多年生的木本植物，所以较之草本植物的花粉富集了更多的生命元素和营养成分，主要包括蛋白质、氨基酸、脂肪、糖类、有机酸、核酸、维生素、矿质元素、不饱和脂肪酸、黄酮、纤维素、多糖、激素、胆碱、酶和辅酶等，成分种类达200余种，且搭配合理。现代营养学表明，每100g松花粉中含有1.76g黄酮。黄酮类化合物具有降低心肌耗氧量、增加脑血管流量、降血糖、降血脂等作用，同时它还是一种天然的抗氧化剂，具有清除人体中超氧离子自由基、抗衰老、增强机体免疫力的生理活性。因此，在化妆品、保健品以及饲料添加剂等方面都有广阔的应用前景。本实验采用溶剂浸提法提取马尾松花粉中的总黄酮类物质，并通过正交实验设计对其提取工艺条件进行优化，从而为松花粉营养成分的研究和保健产品的开发提供一定的参考［1－3］。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纯天然超微破壁马尾松花粉 北京富元康灵生物科技有限公司，食用型，破壁率≥99%;芦丁标准品 湖南中辰科技有限公司，纯度98%;石油醚(沸程:30～60℃)、无水乙醇、乙酸乙酯、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠 北京北化福瑞化工有限公司，分析纯。

VIS－7220型分光光度计 郑州创宇科技有限公司;HH－4型数显恒温水浴锅 金坛市友联仪器研究所;TD5A－WS型台式低速离心机 东星(厦门)电子仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品中总黄酮含量的测定方法 采用“NaNO2－Al(NO3)3－NaOH”方法结合吸光光度法测定松花粉中总黄酮的含量［4］。

1.2.1.1 标准曲线的绘制 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置100mL容量瓶中，加95%乙醇70mL，置于超声波清洗机中使之充分溶解，加95%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得0.1mg/mL的芦丁对照溶液。

精密吸取芦丁对照溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别置于10mL容量瓶中，补充95%的乙醇至5mL，然后加入5%NaNO2溶液0.3mL，使混匀，静置6min;加入10%Al(NO3)3溶液0.3mL，摇匀，静置6min;加入4%NaOH溶液4.0mL，再加95%乙醇定容至刻度，摇匀，静置12min，以空白样作参比，在510nm波长处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，浓度为横坐标，利用线性回归，得出标准曲线及方程(见图1)。

图1 芦丁对照品标准曲线

1.2.1.2 样品总黄酮的提取与测定 准确称取干燥的破壁松花粉2g，置于100mL带有胶塞的锥形瓶中，按照一定的料液比加入浸提剂，在一定的温度条件下提取一定时间，离心取上清，用95%乙醇定容至100mL，然后按1.2.1.1的操作测定吸光度值，并代入上述回归方程，计算得出样品的总黄酮含量。

总黄酮提取率(mg/g)=样品中总黄酮的含量/样品的质量

1.2.2 单因素实验 以样品总黄酮提取率为指标，对浸提剂的种类、浸提温度、浸提剂浓度、料液比、浸提时间等影响总黄酮提取效果的因素进行研究，并考察脱脂处理对总黄酮提取效果的影响。

1.2.3 正交实验 在单因素实验的基础上，通过正交实验对松花粉总黄酮类物质的提取条件进行优化。正交实验因素水平表见表1。

表1 正交实验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 不同提取剂对黄酮类物质提取效果的影响

在料液比(m/v)1∶20、浸提温度70℃、浸提时间2h的条件下，分别采用95%乙醇、乙酸乙酯和蒸馏水提取样品中的黄酮类物质，结果如表2。

表2 不同提取剂对黄酮类物质提取效果的影响

从表2可以看出，蒸馏水的提取效果最差，乙醇作为提取剂时黄酮的提取率最高，这与黄酮在有机溶剂中有较大的溶解性有关。资料表明，黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态不同而有很大差异。一般游离苷元难溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂及稀碱水溶液中。因此，实验中采用乙醇作为提取剂。

2.1.2 脱脂处理对黄酮类物质提取效果的影响 首先用石油醚对松花粉进行脱脂处理，然后称取脱脂和不脱脂松花粉各2g，用95%的乙醇，在料液比1∶20，温度70℃条件下浸提2h，结果见表3。

表3 脱脂处理对松花粉总黄酮提取效果的影响

从表3可以看出，松花粉脱脂处理对黄酮的提取率影响不大，因而从经济角度和操作方便性角度考虑，后续实验均采用不脱脂的松花粉为原料。

2.1.3 提取剂浓度对黄酮类物质提取效果的影响在料液比1∶20、浸提温度70℃、浸提时间2h条件下，用不同浓度的乙醇提取松花粉中的总黄酮类物质，结果见表4。

表4 乙醇浓度对黄酮类物质提取效果的影响

从表4可以看出，当乙醇浓度为90%时，总黄酮提取率最高，因此后续单因素实验中采用90%乙醇作为浸提剂。

2.1.4 料液比对黄酮类物质提取效果的影响 采用90%的乙醇作为提取剂，设定料液比为 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，在温度 70℃ 条件下浸提 2h，结果见表5。

表5 料液比对黄酮类物质提取效果的影响

从表5可以看出，随着料液比的不断减小，总黄酮类物质的提取率随之升高，料液比1∶20时黄酮的提取率最高，之后，随着料液比的继续减小，总黄酮的提取率没有明显改变，考虑到成本及溶剂回收问题，因此后续实验选择1∶20为最适料液比。2.1.5 提取时间对黄酮类物质提取效果的影响 采用90%的乙醇作为提取剂，在料液比1∶20，浸提温度70℃条件下，分别浸提1、1.5、2、2.5、3、3.5h，结果如表6 所示。

表6 提取时间对黄酮类物质提取效果的影响

从表6可以看出，随着提取时间的延长，总黄酮的提取率也随之增大，浸提2.5h时达到最大，而继续延长提取时间，总黄酮提取率又稍有下降，这可能是由于在70℃的条件下长时间的加热会导致黄酮类物质中部分热敏性物质的分解或结构的改变，造成吸光度值的减小，因而提取率会有所下降。因此，选择2.5h为最佳浸提时间。

2.1.6 提取温度对黄酮类物质提取效果的影响 采用90%的乙醇作为提取剂，料液比为1∶20，在不同温度条件下分别浸提时间2.5h，结果见表7。

表7 提取温度对黄酮类物质提取效果的影响

从表7可以看出，提取温度低于70℃时，随温度的升高，黄酮提取率明显增加，温度达70℃时，黄酮的提取率最高。但超过70℃，松花粉中黄酮类物质提取率反而随温度升高而降低。分析其原因，一方面可能是由于温度过高，对黄酮类物质的稳定性有一定的影响，同时温度过高时溶剂挥发严重，结果都会导致总黄酮提取率的降低。因此选择70℃为最适宜提取温度。

2.2 正交实验

在单因素实验的基础上，根据2.3中的设计方案，采用L9(34)表进行正交实验，对马尾松松花粉中总黄酮的提取条件进行优化，结果见表8。

表8 正交实验结果与分析

由表8可知，在考察的三个因素中，影响松花粉中黄酮类化合物提取率的主次顺序依次为:B＞A＞C，即乙醇浓度＞提取温度＞料液比，其最佳的提取条件为A2B3C3，即提取温度70℃、乙醇浓度为95%、料液比1∶25。根据该条件进行实验，所得马尾松花粉总黄酮类物质的提取率为13.52mg/g。

3 结论

3.1 松花粉中含有脂肪酸，比较脱脂与不脱脂的松花粉总黄酮类物质的提取率，结果表明提取效果上没有明显的差别，因而松花粉是否经过脱脂处理对黄酮的提取率影响不大，从经济角度考虑，可采用不经脱脂处理的松花粉作为原料。

3.2 实验采用乙醇作为提取剂，松花粉总黄酮类物质的最佳提取工艺为:乙醇浓度95%、料液比1∶25、提取温度70℃，在此实验条件下总黄酮的提取率为13.52mg/g。

［1］毛永强.松花粉的营养成分及保健功能综述［J］.中国食物与营养，2008(3):50－52.

［2］李娜.松花粉营养成分及生物活性的研究进展［J］.安徽农学通报，2008，14(13):125－127.

［3］王敏.松花粉的成分及药理作用研究发展［J］.安徽医药，2008，12(4):357－358.

［4］罗伟强，李济权，黄梅珍.花生壳中总黄酮含量的测定［J］.西部粮油科技，2002，27(2):48－49.

Extraction of total flavonoids from pinus pollen

LI Xue－mei，CHEN Hui，LI Shu－guo，CAO Ya－hong

(Institute of Biological Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China)

The total flavonoids were prepared from pinus pollen by the organic solvents.The factors which influcing the extraction rate of total flavonoids were studied and optimized through single－factor and orthogonal experimental design.The results showed that fat removal treatment had no manifest influence on the extraction of the total flavonoids.The optimal extraction conditions were as follows:95%ethanol concentration，solid to liquid ratio 1∶25，temperature 70℃，time 2.5h.Under this condition，the extraction rate of total flavonoids was 13.52mg/g.

total flavonoids;pinus pollen;extraction

TS201.2

B

1002－0306(2011)08－0264－03

2010－07－29

李雪梅(1971－)，女，在读博士，副教授，研究方向:食品生物技术与保健食品。