桔梗多糖脱蛋白方法的研究

廖春燕，黄 惠

(广西工学院生物与化学工程系，广西柳州545006)

桔梗多糖脱蛋白方法的研究

廖春燕，黄 惠

(广西工学院生物与化学工程系，广西柳州545006)

目的:探讨桔梗多糖脱蛋白的方法。方法:以蛋白去除率和多糖损失率为指标，比较Sevag法、三氯乙酸－正丁醇法、正丁醇法、AB－8大孔吸附树脂法去除桔梗多糖中蛋白质的效果。结果:AB－8大孔吸附树脂脱蛋白的效果最好，蛋白去除率为90.1%，多糖损失率为17.4%。结论:AB－8大孔吸附树脂蛋白去除率高，且多糖损失率低，是一种有效的脱蛋白方法。

桔梗，多糖，脱蛋白，大孔吸附树脂

桔梗入药始载于《神农本草经》，为临床常用药，味苦、辛，性平，归肺经。药理实验证实，桔梗有抗炎、镇咳、祛痰、抗溃疡、降血压、扩张血管、镇静、镇痛、解热、降血糖、抗胆碱、促进胆酸分泌、抗过敏等广泛作用［1－3］。现代药理研究表明，桔梗多糖具有多种生物活性，如免疫调节、祛痰、保肝、改善胰岛素抵抗、抗炎等［4－6］。韩国学者对桔梗皂苷和多糖类成分进行了大量研究，发现桔梗多糖能激活促进细胞分裂的蛋白酶活性［7］。桔梗多糖大多与蛋白质共存于某一部位，蛋白质或游离蛋白质的酸碱性氨基酸常与多糖上的碱性或酸性基团产生静电结合使游离的蛋白质脱去产生难度。为了提高桔梗多糖的生物活性，得到较高纯度的桔梗多糖，必须去除蛋白质。目前，国内已有对于桔梗多糖的提取方面的报道，但是对于桔梗多糖的纯化方面未见详细报道。脱蛋白的方法有传统的Sevag法、三氯醋酸法等。本实验以蛋白去除率与多糖损失率为考察指标，选用了四种脱蛋白方法进行研究，为桔梗多糖分离纯化提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桔梗 购于柳州市中药材市场;AB－8大孔树脂上海摩速科学器材有限公司;牛血清蛋白、考马斯亮蓝 国药集团化学试剂有限公司;硫酸、苯酚、葡萄糖、乙醇、三氯甲烷、正丁醇、三氯乙酸等试剂 均为分析纯。

UV－2000紫外分光光度计 尤尼科(上海)仪器有限公司;HZ－9212水浴恒温振荡器 太仓市华利达实验设备有限公司;XK96快速混匀器 姜堰市新康医疗器械有限公司;ZFD－5250全自动新型鼓风干燥箱 上海智城分析仪器制造有限公司;LXJ－Ⅱ离心机 上海医分仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 桔梗多糖提取液的制备 选择成熟、无腐烂的桔梗根部，粉碎，过40目筛，80℃烘箱干燥至恒重，备用。称取一定重量的桔梗粉，以蒸馏水为提取剂，料液比为1∶20(m/v)，在温度为80℃的水浴锅中浸提2h，8000r/min下离心20min，取上清液作为多糖提取液。

1.2.2 多糖含量的测定 采用硫酸－苯酚法［8］测定桔梗多糖含量，以葡萄糖为对照品。

1.2.3 蛋白质含量的测定 采用考马斯亮蓝染色法［9］测定蛋白质含量，以牛血清蛋白为标准品。

1.2.4 Sevag法脱蛋白 将氯仿和正丁醇按照体积比为 2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 混合配制成不同比例的 Sevag试剂，取不同比例Sevag试剂与桔梗多糖溶液按体积比为1∶2置于锥形瓶中混合，在30℃下恒温振荡30min，4000r/min条件下离心20min，去除变性蛋白，得澄清液并测定蛋白质和多糖含量。

1.2.5 三氯乙酸－正丁醇法脱蛋白 将三氯乙酸和正丁醇按照体积比为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 混合配制成三氯乙酸－正丁醇混合试剂，将桔梗多糖提取液与上述四种三氯乙酸－正丁醇试剂按照体积比为1∶2置于锥形瓶中混合，在30℃下恒温振荡30min，4000r/min条件下离心20min，弃去沉淀，得澄清液并测定蛋白质和多糖含量。

1.2.6 正丁醇法脱蛋白 将多糖样液与正丁醇按照体积比为 1∶1、2∶3、1∶2、1∶3 分别混合置于锥形瓶内，30℃下恒温振荡30min后放置过夜，在4000r/min条件下离心20min，弃去沉淀，得澄清液并测定蛋白质和多糖含量。

1.2.7 AB－8大孔吸附树脂脱蛋白工艺

1.2.7.1 AB－8大孔吸附树脂的预处理 用去离子水将AB－8大孔吸附树脂洗至无混浊→5%HCl浸泡2～4h→去离子水洗至中性→2%NaOH浸泡2～4h→去离子水洗至中性→乙醇浸泡12h→用去离子水洗至无醇味，备用

1.2.7.2 静态吸附实验 取1g(湿态)AB－8大孔吸附树脂与10mL桔梗多糖提取液(浓度为2mg/mL)混合，置于摇床振摇(110r/min，30℃，pH=7)，在时间间隔为2、4、6、8、10、12、24h 时，取出一定样液分别测定蛋白质和多糖的含量，按式(1)计算树脂对蛋白和多糖的吸附率。

式中，E1为吸附率(%);Co为吸附前的起始浓度(mg/mL);Ce为吸附后的平衡浓度(mg/mL)。

1.2.7.3 动态吸附实验 取预处理过的AB－8大孔吸附树脂，湿法装柱(1.4cm×13cm)，加入25mL浓度为2mg/mL的桔梗多糖提取液，控制吸附流速为1mL/min，等桔梗多糖的溶液吸附完全后用蒸馏水洗脱，洗脱流速为1mL/min，测定洗脱液的蛋白含量和多糖含量，按式(2)计算多糖和蛋白的洗脱率。

式中，E2为洗脱率(%);C2为洗脱液中样品浓度(mg/mL);Co为吸附前的起始浓度(mg/mL);Ce为吸附后的平衡浓度(mg/mL);V1为上样液体积(mL);V2为洗脱液体积(mL)。

1.2.8 数据处理 数据采用SPSS13.0软件进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 不同比例的Sevag试剂对桔梗多糖溶液脱蛋白效果的影响

由图1可知，蛋白去除率随着氯仿和正丁醇体积比的增大而上升，在氯仿和正丁醇体积比大于1∶2时，蛋白去除率变化减小，而多糖损失率增加明显。各组间蛋白去除率和多糖损失率均存在显著性差异(P＜0.05)。综合考虑蛋白去除率和多糖损失率，在氯仿和正丁醇体积比为1∶2时配成的Sevag试剂对桔梗多糖溶液脱蛋白的效果最好，蛋白去除率为59.3%，多糖损失率为21.3%。

图1 不同比例的Sevag试剂对桔梗多糖溶液脱蛋白效果的影响

2.2 三氯乙酸与正丁醇体积比对桔梗多糖溶液脱蛋白效果的影响

由图2可知，蛋白去除率和多糖损失率随着三氯乙酸和正丁醇体积比的增大而增大，在体积比大于1∶10时，蛋白去除率增大缓慢，而多糖损失率增大较快。各组间蛋白去除率和多糖损失率均存在显著性差异(P＜0.05)。综合考虑蛋白去除率和多糖损失率，在三氯乙酸和正丁醇体积比为1∶10时，三氯乙酸与正丁醇试剂对样液脱蛋白效果较好，蛋白去除率为71.8%，多糖损失率为18.5%。

图2 三氯乙酸与正丁醇体积比对桔梗多糖溶液脱蛋白效果的影响

2.3 桔梗多糖溶液与正丁醇试剂体积比对脱蛋白效果的影响

由图3可以看出，蛋白去除率随着桔梗多糖溶液与正丁醇试剂体积比增大而增大，当体积比大于2∶3时趋于平稳。桔梗多糖溶液与正丁醇试剂体积比为1∶3时，蛋白去除率最大(69.2%)，但多糖损失率也最大(43.2%)。体积比为2∶3和1∶2时，蛋白去除率不存在显著性差异(P＞0.05)。体积比为1∶1和1∶2时，多糖损失率不存在显著性差异(P＞0.05);体积比为2∶3时，多糖损失率最小。综合考虑蛋白去除率和多糖损失率，桔梗多糖溶液与正丁醇的体积比为2∶3时，正丁醇试剂对桔梗多糖脱蛋白效果较好，此时蛋白去除率为58.7%，多糖损失率为18.8%。

图3 桔梗多糖溶液与正丁醇试剂体积比对脱蛋白效果的影响

2.4 AB－8大孔吸附树脂脱蛋白工艺

2.4.1 静态吸附实验 由图4可知，树脂对多糖和蛋白的吸附率都随着时间的增加而增大。吸附率在起始阶段明显增加;随着时间延长吸附率增加缓慢，接近12h时，其吸附基本达到平衡。可见，AB－8大孔吸附树脂对桔梗多糖和杂蛋白都有良好的吸附作用，因此可选用AB－8大孔吸附树脂作为桔梗多糖溶液除蛋白的介质。

图4 静态吸附实验

2.4.2 动态吸附实验 由图5可以看出，随着洗脱剂用量的增加，多糖的洗脱率增加，当洗脱剂用量达到25mL后，多糖洗脱率不再明显增加，此时多糖洗脱率达到82.6%。蛋白洗脱曲线显示当洗脱剂用量达到10mL时，蛋白质洗脱基本达到平衡，洗脱率为9.9%，蛋白的洗脱达到平衡。以蒸馏水为洗脱剂，树脂吸附的多糖大部分被洗脱下来，多糖洗脱率为82.6%，即多糖损失率为17.4%;树脂所吸附的蛋白很难洗脱，洗脱率为9.9%，即蛋白去除率为90.1%。

图5 洗脱曲线

2.5 脱蛋白方法的比较

如表1所示，Sevag法和正丁醇法对蛋白去除率无显著性差异(P＞0.05)。三氯乙酸－正丁醇法和正丁醇法、AB－8大孔吸附树脂法对多糖损失率无显著性差异(P＞0.05)。综合考虑蛋白去除率和多糖损失率，用AB－8大孔吸附树脂去除蛋白，蛋白去除率为90.1%，多糖损失率为17.4%，效果最好。结果表明，大孔吸附树脂能有效地去除桔梗提取液的杂蛋白，颜色变化也比较明显，说明树脂不仅可以脱蛋白还可以脱色。

表1 不同脱蛋白方法的比较

3 结论

本实验比较了Sevag法、三氯乙酸－正丁醇法、正丁醇法和AB－8大孔吸附树脂法对桔梗多糖脱蛋白效果的影响。Sevag法和正丁醇法对蛋白去除率无显著性差异(P＞0.05)。AB－8大孔吸附树脂法的蛋白去除率最大。Sevag法、三氯乙酸－正丁醇法和正丁醇法的蛋白去除率较AB－8大孔吸附树脂法小得多。三氯醋酸－正丁醇法和正丁醇法、AB－8大孔吸附树脂法对多糖损失率无显著性差异(P＞0.05)，Sevag法的多糖损失率最大。综合考虑，四种脱蛋白方法中，AB－8大孔吸附树脂法脱蛋白效果最好。AB－8大孔吸附树脂具有较好的吸附和解析能力，以蒸馏水为洗脱剂，用AB－8大孔吸附树脂纯化桔梗多糖溶液，蛋白质去除率达90.1%，多糖损失率为17.4%，效果明显。AB－8大孔吸附树脂用于天然活性物质的分离纯化，该方法具有收率高、成本低、操作简单等特点，可用于实现多糖脱蛋白的工业化生产，并且还对桔梗多糖溶液具有一定的脱色作用。

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Study on the removal of protein from polysaccharide of Platycodon Grandiflorum by macroporous adsorption resin

LIAO Chun－yan，HUANG Hui

(Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Technology，Liuzhou 545006，China)

Objective:The different methods of removing protein from polysaccharide of Platycodon Grandiflorum were studied.Method:The different methods of removing protein including Sevag，trichloroacetic acid－n－Butyl alcohol，butyl alcohol and AB－8 macroporous adsorption resin were compared with the rate of deproteinization and polysaccharide loss as indexes.Result:AB－8 macroporous adsorption resin had the best effect on the removal of protein with the rate of deproteinization and polysaccharide loss were 90.1%and 17.4%.Conclusion:The method of AB－8 macroporous adsorption resin was an effective method for removing protein from polysaccharide extract of Platycodon Grandiflorum with the high rate of deproteinization and the low rate of polysaccharides loss.

Platycodon grandiflorum;polysaccharide;removal of protein;macroporous adsorption resins

TS201.2

B

1002－0306(2011)09－0246－04

2011－01－11

廖春燕(1979－)，女，讲师，硕士，研究方向:生物催化。