酶法制备辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的工艺及其优化

邹 建，刘亚伟

(1.河南商业高等专科学校，河南郑州450045;2.河南工业大学食品学院，河南郑州450001)

酶法制备辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的工艺及其优化

邹 建1，刘亚伟2

(1.河南商业高等专科学校，河南郑州450045;2.河南工业大学食品学院，河南郑州450001)

以玉米淀粉为原料，用α－淀粉酶对合成的辛烯基琥珀酸酐淀粉水解，研究酶法制备辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的工艺条件，并通过响应面分析实验对工艺进行优化。确定合成的最佳工艺参数为:酶用量115U/g，水解温度95℃，水解时间49min，所得产品辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的DE值为8.01。通过响应面方差分析可以得出，三个因素对辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的DE值的影响显著，且加酶量与水解温度、水解温度与水解时间之间的交互影响作用也显著。

辛烯基琥珀酸酐水解淀粉，α－淀粉酶，响应面分析

辛烯基琥珀酸酐水解淀粉是将原淀粉进行辛烯基琥珀酸酐(OSA)酯化，再水解成不同程度的双重改性淀粉［1］。这种产品具有酯化和水解两种改性淀粉的优点，应用于水包油的乳液中可大大提高乳液的乳化性和增稠性，其抗老化性和稳定性与辛烯基琥珀酸酐淀粉相比也有了很大地提高［2］。目前，国内外对辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的研究主要集中在用酸水解制备该复合改性淀粉并对其性质和反应机理进行研究，但是，以玉米淀粉为原料，采用α－淀粉酶水解制备辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的研究较少。本论文以玉米淀粉为原料，首先合成辛烯基琥珀酸酐酯化淀粉(DS=0.019)，然后采用α－淀粉酶对其进行水解，通过单因素实验确定了酶解条件，并利用响应面法优化，以期获得酶解的最佳条件，确定不同水解因素对合成该复合改性淀粉的交互影响作用，为进一步工业合成稳定的辛烯基琥珀酸酐水解玉米淀粉奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米淀粉 市售;辛烯基琥珀酸酐 武汉驰飞化工有限公司;耐高温α－淀粉酶 配制的500mL酶液，其活力为27663U/mL，湖北康宝泰精细化工有限公司。

PHS－25B型数字酸度计 上海大普仪器有限公司;JJ－1型定时电动搅拌器 金坛市华峰仪器有限公司;DZKW－C型电子恒温水浴锅 北京光明医疗器械厂;78HW－1恒温磁力搅拌器 金坛市华峰仪器有限公司;SYO智能玻璃缸恒温水浴锅 巩义市予华仪器有限公司;SB233268乌氏粘度计 北京科思佳公司。

1.2 实验方法

1.2.1 辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的制备

1.2.1.1 玉米淀粉的酯化 准确称量一定质量的淀粉，溶解在去离子水中，配制成35%的淀粉溶液，用电动搅拌器不停的搅拌，并将反应容器放入一定温度的恒温水浴中。用2%的氢氧化钠把淀粉溶液的pH控制在8.0～8.5，取一定量的OSA(辛烯基琥珀酸酐)加入到淀粉溶液中，反应一定的时间后，用5%的盐酸溶液将淀粉溶液的pH调整为6.5，浓浆抽滤，烘干，贮存备用。

1.2.1.2 辛烯基琥珀酸酐淀粉的酶解 取一定量的辛烯基琥珀酸酐淀粉配制成35%浓度的淀粉溶液，将pH调节到6.0～6.5，放入恒温水浴中使淀粉彻底糊化，然后加入一定量的耐高温液化酶，恒温反应一段时间，反应过程中不断用搅拌器搅拌，反应结束后用HCl溶液将反应溶液pH调节至6.5。静置一段时间后，用不同浓度的乙醇溶液洗涤沉淀产品，直至将产品中的水全部洗出为止，在干燥箱中过夜干燥。

1.2.2 测定指标

1.2.2.1 淀粉水分含量测定 淀粉水分含量的测定:按GB12087－89方法测定。

1.2.2.2 辛烯基琥珀酸酐淀粉取代度(DS)的测定［3］

称取1.5g(干基)样品置于100mL烧杯中。加入50mL 95%乙醇，在磁力搅拌器上搅拌10min，加15mL 2mol/L盐酸的乙醇溶液酸化30min。将样品倒入布氏漏斗中，用90%的乙醇抽滤洗涤至无Cl－(硝酸银溶液检验)。再将样品转移入250mL的三角瓶中，加入100mL的蒸馏水，沸水浴中加热20min，在溶液中滴加两滴酚酞试剂，趁热用0.1mol/L的NaOH滴定至粉红色。同时制备不加入酸酐的样品为空白。

注:A:每克淀粉所消耗的0.1mol/L NaOH标准溶液的量，mmol。

式中:V－滴定待测样品所消耗的氢氧化钠溶液的体积，mL;M－氢氧化钠溶液的摩尔浓度，mol/L;m－待测样品的质量，g。

1.2.2.3 辛烯基琥珀酸酐水解淀粉葡萄糖当量(DE值)的测定［4］采用直接滴定法进行测定，用还原糖量间接反映DE值的高低。

1.2.2.4 响应面优化酶解工艺实验 在水解单因素实验的基础上，利用响应面分析软件(design expert6.0)设计实验，优化酶解工艺条件。

1.2.2.5 水解单因素实验方法 以实验室合成的辛烯基琥珀酸酐淀粉(DS=0.019)为原料，在耐高温淀粉酶的最佳pH范围为6.2～6.5下进行反应，分别选择加酶量(U/g)、水解温度(℃)、水解时间(min)三个因素进行单因素实验，其中:水解温度对DE值的影响单因素实验条件为:α－淀粉酶用量90U/g、水解时间30min;α－淀粉酶用量对DE值的影响单因素实验条件为:水解温度92℃、水解时间30min;水解时间对DE值的影响单因素实验条件为:水解温度92℃、α－淀粉酶用量90U/g。

2 结果与讨论

2.1 酶解工艺的单因素实验

耐高温淀粉酶的最佳pH范围为6.2～6.5，分别选择加酶量(U/g)、水解温度(℃)、水解时间(min)进行单因素实验，实验结果如下:

2.1.1 水解温度对DE值的影响 从图1可以看出，在水解时间和加酶量一定的情况下，随着水解温度的升高，水解DE值逐渐升高。分析原因为，淀粉在水解过程中先要吸水膨胀，体积迅速增加，晶体结构破坏，颗粒外膜裂开，形成一种糊状的粘稠液体即淀粉的糊化。淀粉经过糊化作用后，虽然原有的淀粉链还未真正打开，但是由于外膜已经裂开，晶体结构受到破坏，淀粉分子就直接暴露在酶分子的作用之下，分子链即迅速断开、变短，糊液粘度降低，形成低分子糊精溶液［5］。同时，随着水解温度的升高，一方面耐高温淀粉酶的活性提高，活力增加，使得其对淀粉的水解程度提高，另一方面由于温度的升高，淀粉糊化更加彻底，这样有助于淀粉酶的水解作用，因此复合改性淀粉的DE值逐渐升高。

图1 水解温度对DE值的影响

2.1.2 α－淀粉酶用量对DE值的影响 从图2可以看出，在水解时间和水解温度一定的情况下，增加淀粉酶的量可以提高淀粉的水解程度。原因是随着淀粉酶用量的增加，酶作用于淀粉的几率也相应的增加，使得淀粉水解程度提高。但当淀粉酶用量持续增大时，反应效率会随之下降，复合改性淀粉的DE值增大趋势变缓。

图2 α－淀粉酶用量对DE值的影响

2.1.3 水解时间对DE值的影响 从图3可以看出，在淀粉酶用量和水解温度一定的情况下，随着反应时间的延长，水解DE值逐渐升高，从30min到60min时增加的较为明显，60min后再延长时间DE值增加的趋势不是很明显。这是因为α－淀粉酶是一种内切酶，随机的水解α－1，4－糖苷键，不能水解支叉部位的α－1，6－糖苷键，但是可以越过此键，继续水解α－1，4－糖苷键，由于淀粉中其自身的 α－1，6－糖苷键和底物的酯键二者的双重作用，影响了酶的水解速度［6］，即使延长了反应时间，水解DE值升高也不明显。因此，要想获得高DE值的产品，水解时间不宜过长。

2.2 响应面法优化酶解工艺条件

图3 水解时间对DE值的影响

在单因素实验的基础上，利用响应面分析软件，选取α－淀粉酶用量、水解温度、水解时间作为三个因素，因素水平表如表1所示，结果见表2。

表1 响应面实验因素水平表

表2 响应面实验方案及测定结果

根据表中的实验组合以及所测得DE值，利用响应面分析软件，可以得出三个因素与DE值之间得回归关系式:

方差分析结果如表3所示。

表3 响应面方差分析结果

从响应面方差分析表中可以看出，在水解响应面分析实验中加酶量与水解温度、水解温度与水解时间之间的交互影响作用明显，具体分析原因如下。

2.2.1 加酶量和水解温度之间的交互作用 由图4可以看出，在同一温度下，随着加酶量的增加，水解的DE值是逐渐升高的，这是因为增加酶的用量后，反应体系中的酶增加，它作用于淀粉分子的机会就相应的增加了，用量越多水解的程度越大，造成DE值升高［7］。

图4 加酶量和水解温度之间的交互作用

从图4还可以发现酶用量增加后，DE值在高温下增加的趋势明显高于低温，在同一酶用量的情况下，随温度的升高，DE值逐渐升高，说明温度对水解反应是一个重要的因素。原因为:α－淀粉酶是内切酶，随温度的升高，淀粉链的活动性增加，有利于酶对淀粉链的进攻［8］，随着温度的升高，淀粉溶解度增加，底物淀粉的浓度增加，酶活力的稳定性增强，水解率增加。

2.2.2 水解温度和水解时间的交互作用 由图5可以看出，水解时间一定时，随着反应温度的升高，水解DE值逐渐升高。当温度一定时，随着水解反应时间的延长，水解DE值也是逐渐升高的，原因之前单因素实验分析已经论述。

图5 水解温度和水解时间的交互作用

由图5还可知，温度较低时随着反应时间的延长，水解DE值增加的很明显，但在高温下，水解DE值增加的却不是很明显。说明α－淀粉酶的水解反应适合高温短时下进行反应，也可以在低温长时下反应［9］。

2.3 合成辛烯基琥珀酸酐水解淀粉最佳工艺条件

以制取DE值为8的辛烯基琥珀酸酐水解淀粉为例，响应面给出十个最佳工艺条件(表3)，可以从中选取合适的条件来制备。

最佳工艺条件的验证:选取上述10个最佳条件中的任意四个进行验证实验。

因此可以选择10号为最佳条件，修正后为:酶用量115U/g，水解温度95℃，水解时间49min，所得辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的DE值为8.01。

表4 水解最佳条件验证

表3 实验最佳条件方案表

3 结论

采用响应面法优化酶法制备辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的工艺参数，以α－淀粉酶用量、水解温度、水解时间作为三个因素，采用Central composite design设计和Design 6.0软件进行统计分析，确定最佳的工艺参数为:酶用量115U/g，水解温度95℃，水解时间49min，所得产品辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的DE值为8.01。通过响应面方差分析可以得出，三个因素对辛烯基琥珀酸酐水解淀粉的DE值的影响显著，且加酶量与水解温度、水解温度与水解时间之间的交互影响作用也显著。

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Optimization condition of octenyl succinic anhydride hydrolysis starch by enzymolysis

ZOU Jian1，LIU Ya－wei2

(1.Henan Business College ，Zhengzhou 450045，China;2.Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China)

The synthesis process condition of enzymatic octenyl succinic anhydride(OSA)corn starch was researched.Through hydrolysis response surface analysis，the results showed that the optimum condition of synthesizing enzymatic OSA corn starch(DE=8.01)was enzyme dosage 115U/g，hydrolysis temperature 95℃，hydrolysis time 49 minutes;enzyme dosage and hydrolysis temperature，hydrolysis temperature and hydrolysis time interacted significantly;DE value increased significantly higher in high temperature than in low temperature.

enzymatic octenyl succinic anhydride hydrolysis starch;α－amylase;response surface analysis

TS231

A

1002－0306(2011)09－0174－04

2011－04－18

邹建(1981－)，讲师，在职博士，研究方向:食品添加剂及传统食品工业化研究。