葡萄籽原花青素对肾血管性高血压大鼠血压的影响*

吴秀香， 郭荣年， 郭瑞珍， 唐剑涛， 靳俊峰

(遵义医学院珠海校区1病理学与病理生理学教研室，2计算机教研室, 广东 珠海 519041)

葡萄籽原花青素对肾血管性高血压大鼠血压的影响*

吴秀香1△， 郭荣年1， 郭瑞珍1， 唐剑涛2， 靳俊峰1

(遵义医学院珠海校区1病理学与病理生理学教研室，2计算机教研室, 广东 珠海 519041)

目的观察葡萄籽原花青素(GSP)对肾血管性高血压(RH)大鼠血压的影响并对其机制进行初步探讨。方法采用两肾一夹(2K1C)法建立RH大鼠模型，并设假手术组(control，n=8)。术后2周，选取鼠尾动脉收缩压升至130 mmHg以上的大鼠32只为RH大鼠，随机分为4组(n=8)：高血压模型组(RH model)；GSP低剂量治疗组(low GSP，50 mg·kg-1· d-1)；GSP高剂量治疗组(high GSP，200 mg·kg-1· d-1)和卡托普利阳性对照治疗组(captopril，30 mg·kg-1· d-1)。治疗6周后，分别测定大鼠血压、血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、 丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)含量，以及总抗氧化能力(T-AOC)；Western blotting法检测腹主动脉中内皮素-1(ET-1)的蛋白表达。结果治疗6周后，与control组相比，RH model组大鼠的尾动脉收缩压明显升高(P<0.01)；与RH model组相比，GSP能显著降低RH大鼠的尾动脉收缩压、MDA含量及主动脉组织中ET-1的蛋白表达(high GSP组)，升高大鼠血清中SOD活性、NO含量(high GSP组)和T-AOC。结论GSP能显著降低RH大鼠的尾动脉收缩压，其机制可能与其增强大鼠抗氧化能力，增加NO的产生和释放，降低血管内皮中ET-1的蛋白表达有关。

葡萄籽原花青素； 肾血管性高血压； 内皮缩血管肽1; 一氧化氮

高血压病是目前公认的危害人类健康最严重的疾病之一，因此如何防治高血压病一直是心血管领域重要的研究课题[1]。近年来的研究表明，葡萄籽原花青素(grape seed procyanidin，GSP)具有很强的清除自由基和抗氧化[2]、心血管保护[3,4](包括抗血小板凝聚、抗缺血再灌注损伤、舒张血管等)、减轻水肿和降低毛细血管通透性[5]等药理作用，这些作用多数与高血压病的发生机制(如氧化应激[6]、炎症[7]、血管内皮细胞功能紊乱致舒张血管物质产生减少，收缩血管物质产生增多[8]等)相关，因而推测其应具有降压作用，但关于葡萄籽原花青素是否具有降压作用及机制如何，少见报道。本文拟用肾血管性高血压(renovascular hypertensive，RH)大鼠模型观察治疗性给予GSP后大鼠血压的变化，并对其机制进行初步探讨，以期为开发GSP成为治疗高血压病的理想新药奠定理论基础。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 清洁级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(180-200 g)，购自广东省医学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2008-0002。

1.2药物 GSP，购自天津尖峰天然产物研究开发有限公司，纯度≥95%；卡托普利(captopril)，中美上海施贵宝制药有限公司产品。

1.3主要试剂和仪器 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malonaldehyde,MDA )、总抗氧化能力(total antioxidant capacity， T-AOC) 和一氧化氮(nitric oxide，NO)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；兔抗鼠内皮素-1(endothlin-1，ET-1)、辣根过氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔Ⅱ抗(武汉博士德生物工程有限公司)；蛋白分子量标准(MBI)；蛋白电泳仪(Bio-Rad)；大鼠尾动脉压测定装置、多道生理信号采集处理系统(RM6240型，成都仪器厂)。其余试剂为市售分析纯。

2方法

2.1RH大鼠模型复制 50只SD大鼠称重、测量基础尾动脉压，随机分为手术组和假手术组(control，n=8)。手术组在乙醚麻醉下行腹部正中切口，钝性分离出左肾动脉，用直径为0.20 mm的针灸针与肾动脉长轴平行放置，与无菌丝线一齐扎紧，然后抽出针灸针，造成左肾动脉部分狭窄，右肾保持不动，复制肾血管性高血压模型。术后3 d内常规肌注青霉素(4×104U，bid)。Control组手术步骤同前，但不结扎肾动脉。术后各组大鼠每周测量大鼠尾动脉压，连续测量3次，取平均值。术后2周，选取鼠尾动脉压升至130 mmHg以上的大鼠共32只，为复制成功的RH大鼠。

2.2动物分组及给药方法 32只RH大鼠随机分为4组：高血压模型组(RH model)；GSP高剂量治疗组(high GSP)；GSP低剂量治疗组(low GSP)和卡托普利阳性对照治疗组(captopril)，每组8只。于模型复制成功后，治疗组大鼠每天灌胃给药1次，剂量分别为：GSP，200mg·kg-1· d-1；50 mg·kg-1· d-1；captopril，30 mg·kg-1· d-1。Control组及RH model组每天以相同体积的蒸馏水灌胃。

2.3T-AOC能力、SOD活性、MDA和NO含量的测定 主动脉取血，制备血清，严格按照试剂盒说明书进行测定。

2.4主动脉组织总蛋白的提取和Western blotting检测ET-1蛋白表达 取大鼠腹主动脉，按照质量体积比1∶9加入匀浆液(含组织蛋白抽提试剂，多种蛋白酶抑制剂cocktail)进行匀浆，加入等体积的2×上样缓冲液，煮沸10 min使蛋白变性， 12 500 r/min 4 ℃离心15 min取上清液，BCA法(武汉博士德)测定样品的蛋白浓度。用上样缓冲液调整蛋白浓度，使各泳道的蛋白上样体积为10 μL(含蛋白20 μg)。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转印至硝酸纤维膜(NC膜)上，经脱脂奶粉封闭、洗脱后加抗ET-1抗体(1∶200)4 ℃过夜孵育，再加相应Ⅱ抗(1∶2 000)孵育2 h。加ECL发光显示剂，暗盒压片、曝光，显影、定影于胶片。

3统计学处理

结 果

1GSP对RH大鼠尾动脉收缩压(systolicbloodpressure,SBP)的影响

灌胃6周后，与control组相比，RH model组大鼠尾动脉SBP明显升高(P<0.01)；与RH model组相比，GSP的2个剂量治疗组能显著降低高血压大鼠的尾动脉 SBP(P<0.01)，以高剂量组的效果更明显，见表1 。

2GSP对RH大鼠血清中MDA含量、SOD活性和T-AOC的影响

灌胃6周后，与control组相比，RH model组大鼠血清中的MDA含量显著增高(P<0.01)，而SOD活力、T-AOC显著降低(P<0.05)；与RH model组相比，high、low GSP组大鼠血清中 MDA含量显著降低(P<0.01)，captopril组的此项指标则未见明显变化；3个治疗组的SOD活性、T-AOC则明显升高(P<0.01)，见表1。

3GSP对RH大鼠血清中NO含量的影响

灌胃6周后，与control组相比，RH model组大鼠血清中的NO含量显著降低(P<0.01)，与RH model组比较，high GSP组大鼠血清中的NO含量显著增高(P<0.01)，low GSP组、captopril组也有增高，但无显著差异(P>0.05),见表1。

表1 GSP对各组大鼠尾动脉SBP、血清中MDA含量、SOD活性 、T-AOC和NO水平的影响

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsRH model.

4GSP对RH大鼠腹主动脉组织中ET-1蛋白表达的影响

RH model组ET-1蛋白表达明显增多，各治疗组的ET-1蛋白表达有不同程度的降低，以High GSP组的降低尤为明显(P<0.01),见图1。

图1Westernboltting检测ET-1蛋白表达

讨 论

本实验结果显示，给RH大鼠灌胃高剂量和低剂量的GSP，均能显著降低RH大鼠的尾动脉SBP，其降压效果与阳性对照药captopril的效果相当(P>0.05)，证实了GSP确有明显的降压作用，与国外学者在其它高血压的动物模型上观察到GSP具有降压作用的实验结果一致[9]。

有研究表明，高血压病的发生机制之一是由于机体氧自由基产生显著增多，而内源性氧自由基清除剂如SOD等活力明显降低，从而导致机体总抗氧化能力减弱，机体处于氧化应激状态[6]。我们通过实验发现，与control 组相比，RH model组大鼠血清中脂质过氧化产物MDA含量显著升高，SOD活性及机体T-AOC能力明显降低；而用GSP治疗6周后，随着大鼠血压的降低，大鼠血清中MDA含量明显降低，而SOD活性及机体T-AOC能力显著升高，提示GSP的降压机制与减少氧自由基的生成、提高清除自由基的酶活性进而增强机体总抗氧化能力有关。

诸多研究[10]以及我们以往的研究[8]发现，多种类型高血压可导致血管内皮细胞(vascular endothelial cells， VECs)功能紊乱，表现为NO的合成和释放减少，ET的合成和释放量显著增加。本实验结果显示，RH model组的大鼠血清中NO含量明显低于control组，而主动脉组织中ET-1的蛋白表达明显高于control组；应用GSP治疗后，各治疗组大鼠血清中的NO含量和主动脉组织中ET-1的蛋白表达分别高于、低于RH model组，以GSP高剂量组尤为明显(P<0.01)。此结果提示，GSP可能通过改善受损的VECs功能而发挥降压作用。

综上所述，GSP能通过抗氧化应激、增强机体总抗氧化能力，同时促进VECs合成和释放舒张血管物质NO，减少收缩血管物质ET-1蛋白的表达而发挥降压作用。鉴于目前防治高血压病的药物有一些明显的副作用，而GSP来源广泛易得，毒副作用低(目前尚未见有毒副作用的报道)，因此认为GSP可作为治疗高血压病的理想药物的候选者之一。至于GSP的降压作用是否还涉及其它机制，尚需进一步探讨。

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[2] Bagchi D，Bagchi M，Stohs SJ，et al.Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease prevention[J].Toxicology,2000，148(2-3)：187-197.

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[6] 陈 琦，吴延庆，程晓曙. 氧自由基与高血压[J]. 实用临床医学，2003，4(1):130-133.

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Effectsofgrapeseedprocyanidinonbloodpressureinrenovascularhypertensiverats

WU Xiu-xiang1, GUO Rong-nian1, GUO Rui-zhen1, TANG Jian-tao2, JIN Jun-feng1

(1DepartmentofPathologyandPathophysiology,2DepartmentofComputer,ZhuhaiCampusofZunyiMedicalCollege,Zhuhai519041,China.E-mail:wxx64@sina.com)

AIM: To investigate the effects of grape seed procyanidin (GSP) on the blood pressure in renovascular hypertensive (RH) rats.METHODSThe RH rat model was established by 2K1C method. Two weeks after operation, 32 rats were selected according to the increased tail systolic pressure above 130 mmHg and randomly divided into 4 groups (n=8): renovascular hypertensive model group (RH model); low GSP-treated group (low GSP, 50 mg·kg-1·d-1); high GSP-treated group (high GSP, 200 mg·kg-1·d-1) and captopril-treated group (captopril, 30 mg·kg-1·d-1). Meanwhile, 8 rats with sham operation were served as controls. The tail systolic pressure, the activity of superoxide dismutase (SOD), the content of malonaldehyde (MDA) and nitric oxide (NO) level in serum and total antioxidant capacity (T-AOC) were determined 6 weeks after treatment. Western blotting was performed to detect the expression of endothlin-1 (ET-1) in abdominal aortic tissues.RESULTSCompared with control group, the tail systolic pressure in RH model group was increased significantly. In the RH model rats, treatment with GSP reduced the tail systolic pressure, MDA level and the expressions of ET-1 (only in high GSP group), and increased the activity of SOD, NO level (only in high GSP group) and T-AOC.CONCLUSIONGSP significantly decreases the tail systolic pressure in RH rats by increasing antioxidative ability and NO production, and reducing the expression of ET-1 in aortic endothelium in the rats.

Grape seed procyanidin; Renovascular hypertension; Endothelin-1; Nitric oxide

R544.1； R282.71

A

1000-4718(2011)03-0593-03

2010-08-07

2010-11-10

珠海市科技局资助项目(No.PC20071045)；贵州省科技厅资助项目(No. 黔科合J字[2008]2)；贵州省高层次人才科研条件特助经费资助项目(No.TZJF-2008年58号)

△通讯作者 Tel：0756-7623356；E-mail：wxx64@sina.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.034